摘要
甘草是我国最大宗的常用中草药之一，含有丰富的活性物质，如黄酮类和三萜皂苷类化合物。甘草查尔酮A(licochalconeA，LCA)，是甘草中一种黄酮类物质，具有抗炎症、抗氧化、抗菌和抗肿瘤等活性，在医疗和美容行业中有广泛的应用。LCA是胀果甘草中一种特征性化合物，在甘草中含量低、价格昂贵，市场供不应求。甘草查尔酮A完整的生物合成途径及其调控机制还尚未有报道。本研究从LCA的合成途径解析及其调控机制入手，解析了影响其合成途径的P450酶GiF2H(flavanone2-hydroxylase)和GiIFS(isoflavonesynthase)的生化功能，并初步探讨茉莉酸甲酯(methyljasmonicacid，MeJA)及蔗糖调控LCA积累的分子机制。主要研究结果如下: 1、胀果甘草中GiF2H2和GiIFS影响LCA的合成。两年生胀果甘草根、乌拉尔甘草根和光果甘草根代谢组的比较分析结果表明，LCA、甘草香豆素和光甘草定分别是胀果甘草、乌拉尔甘草和光果甘草的特征化合物。查尔酮合成酶、查尔酮异构酶、细胞色素P450、氧甲基转移酶和异戊烯基转移酶等家族参与这三种化合物的生物合成。分析胀果甘草叶与根的转录组，发现GiF2H、GiI2''H（isoflavone2''-hydroxylase）、GiIFR（isoflavonereductase）、GiOMT（O-methyltransferase）和GiPT(prenyltransferase)基因在根部高表达，RT-qPCR验证了这一结果。分析胀果甘草基因组中P450基因家族发现GiF2H2催化甘草素生成番茄二酮和7，4''-二羟基黄酮，而GiIFS则催化甘草素生成大豆苷元。过表达GiF2H2的转基因毛状根中刺甘草查尔酮和LCA/C/E含量显著增加，而过表达GiIFS的转基因毛状根中刺甘草查尔酮和LCA/C/E含量显著减少，说明代谢流转向LCA合成的旁支通路。此外，MeJA上调GiF2H2的表达且促进LCA合成，但其并不影响GiIFS的表达。 2、一个MeJA诱导的转录因子GiMYB1能促进胀果甘草LCA的积累。MeJA诱导胀果甘草根部LCA及总黄酮含量的积累。在甘草毛状根中过表达一个响应MeJA并调控类黄酮生物合成的拟南芥转录因子AtMYB12，提高了转基因毛状根中刺甘草查尔酮和LCA含量。本研究分析了胀果甘草基因组中GiMYB转录因子家族，共获得130个GiMYB转录因子，其中69个GiMYB转录因子响应MeJA。通过氨基酸序列比对及系统发育树分析，获得AtMYB12的同源基因Gi3.505、Gi2.607和Gi4.3404，三个基因属于subgroup7MYB转录因子。其中，仅有Gi3.505在根部表达并且被MeJA诱导，因此将Gi3.505命名为GiMYB1。亚细胞定位实验表明，GiMYB1定位在细胞核中。过表达GiMYB1的转基因毛状根中LCA的含量增加，表明GiMYB1调控LCA的生物合成。此外，本研究分析了胀果甘草中GiCHS（chalconesynthase）基因家族，共有21个GiCHS基因，其中10个GiCHS基因被MeJA诱导。酵母单杂交实验、启动子活性实验及DAP-seq结果表明，GiMYB1结合并激活GiCHS4的启动子。DAP-seq结果表明，GiMYB1可能结合到GiCHI、GiOMT、GiPT及GiP450启动子。其中，4个GiCHS、2个GiPT和14个GiP450既被MeJA诱导，也可能直接被GiMYB1结合。这些基因将作为LCA合成途径的候选基因，后续进行功能验证。 3、本研究发现10％蔗糖处理显著促进胀果甘草根部LCA的含量。蔗糖处理的胀果甘草小苗根部的转录组分析结果发现，胀果甘草根通过影响基因的表达进而响应蔗糖的刺激。GO(GeneOntology)分析结果表明，差异表达基因主要富集在代谢途径及催化活性。KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)分析结果表明，差异表达基因主要富集在次生代谢物生物合成途径，尤其是黄酮类物质的合成。在这些差异表达基因中，8个GiCHS、5个GiOMT、2个GiPT以及25个GiP450可能参与LCA生物合成，并被蔗糖诱导。蔗糖诱导7个未知的GiMYB的表达，但并不诱导GiMYB1的表达，诱导蔗糖转化酶GiINV的表达，但并不影响蔗糖信号途径中GID(Gibberellininsensitivedwarf)和GAI(GibberellicAcidInsensitive)的表达。本研究推测蔗糖在GiINV(Invertase)的作用下分解为葡萄糖和果糖，为LCA的积累提供碳源。另外，蔗糖可能通过诱导调控LCA合成途径基因的GiMYB的表达，进而促进LCA的积累。 综上所述，GiF2H2和GiIFS影响胀果甘草特征化合物LCA的生物合成。此外，响应MeJA的转录因子GiMYB1通过激活GiCHS4的表达调控LCA的积累。最后，蔗糖可能通过影响糖酵解途径和转录因子的表达水平调控LCA的积累。本研究的结果有助于通过分子手段提高甘草体内药用成分的含量，提高甘草的经济价值。另一方面，研究胀果甘草LCA的合成与调控，还可以从理论上提高人们胀果甘草LCA合成与调控机制的认识。
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