摘要
目的： 探讨第一代非小细胞肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EpidermalGrowthFactorReceptorTyrosineKinaseInhibitor，EGFR-TKIs）吉非替尼（Gefitinib）耐药的产生与自噬受体分子1（NeighborofBrca1，NBR1）介导的主要组织相容性复合体Ⅰ（MajorHistocompatibilityComplex，MHC-Ⅰ）自噬降解重塑肺腺癌TKIs耐药微环境是否存在相关性，以及NBR1与MHC-Ⅰ分子表达与肺腺癌患者临床病理特征、3年生存期和TKIs获得性耐药复发之间的相关性，为进一步攻克EGFR-TKIs耐药的分子机制提供理论依据。 方法： 1.选择初诊未治疗的EGFR阳性肺腺癌患者手术或穿刺标本及接受TKIs药物治疗后耐药复发患者的穿刺标本；采用免疫组织化学方法检测肺腺癌细胞中MHC-Ⅰ、NBR1表达情况、组织中CD8+T淋巴细胞浸润情况，采用卡方检验法分析MHC-Ⅰ、NBR1以及CD8+T淋巴细胞与耐药之间的相关性；采用Kaplan-Meier生存分析法绘制生存曲线；采用Spearman检验方法分析MHC-Ⅰ与NBR1相关性。 2.根据实验需要将质粒成功构建入慢病毒载体后，利用病毒颗粒转染PC9细胞(exon19del.E746-A750)，将目的基因过表达或沉默。然后对EGFR突变PC9细胞进行不同的处理，分为5组：①TKIs单独诱导组，②NBR1过表达组；③TKIs诱导联合NBR1沉默组；④TKIs诱导联合自噬抑制剂组；⑤未处理组。通过采用免疫蛋白印迹法，检测上述不同处理组MHC-Ⅰ及NBR1的表达水平；采用免疫荧光法，检测上述不同处理组肺腺癌细胞MHC-Ⅰ与溶酶体关联膜蛋白（RecombinantLysosomalAssociatedMembraneProtein2，LAMP2）共定位情况。 3.应用健康人群外周血CD8+T淋巴细胞与上述5组细胞进行共培养后，采用流式细胞术，检测CD8+T淋巴细胞Ki67、分泌颗粒酶（GranzymeB）及穿孔素（Perforin）的表达水平，以及与其共培养的肺腺癌PC9细胞凋亡诱导水平。 4.运用SPSS26.0进行数据统计学处理，采用χ2检验或Fisher的精确检验，应用Kaplan-Meier绘制生存曲线等，检验水准为p＜0.05。 结果： 1.免疫组化结果发现初诊未治肺腺癌患者的肿瘤细胞表面可见着色的MHC-Ⅰ，NBR1表达弱阳性，CD8+T淋巴细胞浸润多；而TKIs药物复发耐药肺腺癌患者肿瘤细胞胞膜MHC-Ⅰ蛋白表达降低，NBR1表达显著增高，CD8+T淋巴细胞浸润减少。而且MHC-I低表达、NBR1高表达以及CD8+T淋巴细胞浸润减少与肺腺癌患者复发耐药之间存在正相关性，MHC-Ⅰ及NBR1蛋白表达之间呈负相关。 2.免疫蛋白印记法及免疫细胞荧光实验等体外实验结果表明，TKIs触发溶酶体自噬从而引导NBR1介导的MHC-Ⅰ降解； 3.将不同处理组PC9细胞与CD8+T淋巴细胞体外共培养，采用流式细胞术，检测CD8+T淋巴细胞Ki67、GranzymeB、Perforin分泌水平以及肿瘤细胞凋亡水平；与对照组相比，单独使用TKIs诱导组及单纯NBR1过表达组中CD8+T淋巴细胞Ki67、GranzymeB、Perforin分泌水平以及肿瘤凋亡水平显著减低；使用TKIs诱导联合NBR1沉默组和使用TKIs诱导联合自噬抑制剂氯喹组与单独使用TKIs诱导组相比，CD8+T淋巴细胞Ki67、GranzymeB及Perforin分泌水平和肿瘤细胞凋亡水平增高。 结论： 1.TKIs药物可诱导促使NBR1表达增高，从而诱导膜表面MHC-Ⅰ通过NBR1介导进入溶酶体-自噬途径发生降解，导致肿瘤细胞表面抗原呈递异常，CD8+T淋巴细胞无法识别肿瘤细胞，致使肿瘤微环境抑制和耐受，无法协同TKIs药物发挥抗肿瘤的效应，最终导致TKIs获得性耐药， 2.本研究进一步阐明TKIs诱发NBR1介导MHC-Ⅰ自噬降解从而导致的免疫微环境抑制是TKIs获得性耐药机制之一，为NBR1可能成为未来攻克肺腺癌耐药的靶点之一提供理论基础。
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