摘要
第一部分：Se@SiO2纳米颗粒的合成与鉴定 实验目的：硒作为人体必须的一种微量元素，能调控氧化应激反应，对肿瘤治疗过程中出现的并发症及副作用有一定的防护作用。然而，硒元素的安全剂量窗相对狭窄，这也限制了其在临床及其他领域的应用。当硒以纳米形式存在时，其生物毒性会显著降低。本部分研究制备了一种由聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）包被的、具有多孔结构的Se@SiO2纳米颗粒。该材料表面具有多孔结构能够保证纳米硒的缓慢释放，使用SiO2包被使其具有更高的生物安全性。 材料和方法：材料合成与鉴定：1.制备Cu2-xSe纳米晶体：硒粉经过油酸、氨气、氯化铜（CuCl）等处理合成Cu2-xSe纳米晶体。2.Cu2-xSe纳米晶体与正己烷、正硅酸乙酯、去离子水等混合。通入氨气，Cu2-xSe纳米晶体与氨气反应产生[Cu（NH3）4]2+以及Se2-。氧气将Se2-氧化合成Se量子点，正硅酸乙酯发生水解产生二氧化硅并使溶液呈现碱性，在碱性环境中二氧化硅覆盖在硒量子点周围，形成Se@SiO2纳米颗粒。最后，用PVP涂覆在Se@SiO2纳米粒子表面并在95℃热水中构建多孔结构。合成多孔Se@SiO2纳米颗粒后，我们使用X射线衍射（XRD）以及扫描透射电子显微镜（TEM）对Se@SiO2纳米颗粒进行表征。使用CCK-8试剂盒检测Se@SiO2纳米颗粒的细胞毒性。 结果：本方法合成的多孔Se@SiO2纳米颗粒是大小为~55nm的多孔球状结构，多孔Se@SiO2纳米颗粒中的硒能在pH7.4、37℃的条件下缓慢释放10天，具有一定缓释性。当多孔Se@SiO2纳米颗粒浓度大于200μg/ml时，会显著抑制细胞活性。 结论：在本部分实验中合成的多孔Se@SiO2纳米颗粒具有缓释性以及稳定性等优点，为后续的体内外实验提供了实验可行性。 第二部分：多孔Se@SiO2纳米颗粒对海马细胞氧化应激的作用及机制研究 实验目的：利用H2O2体外建立氧化应激模型。确定多孔Se@SiO2纳米颗粒在体外的安全使用浓度，验证其抗氧化应激作用。同时探究多孔Se@SiO2纳米颗粒对海马神经元的保护作用以及机制研究。 材料和方法：选用小鼠海马神经元细胞系HT-22，通过CellCountingKit-8（CCK-8）实验确定H2O2的刺激浓度。使用H2O2刺激HT-22细胞，模拟体外氧化应激环境。H2O2刺激的HT-22细胞，同时加入不同浓度的Se@SiO2纳米颗粒，通过ROS探针DCHF-DA检测细胞氧自由基水平；实时定量PCR反映检测细胞炎症水平；流式细胞凋亡检测、JC-1免疫荧光反映HT-22细胞凋亡情况。通过蛋白印迹法（WB）明确多孔Se@SiO2纳米颗粒抑制氧化应激的作用机制。 结果：200μM的H2O2可以显著抑制HT-22细胞活性。DCHF-DA免疫荧光提示，H2O2刺激后细胞内氧自由基水平增加，而Se@SiO2纳米颗粒能抑制胞内活性氧水平。实时定量PCR结果表明，Se@SiO2可以抑制H2O2引起的炎症因子表达，并且该抑制作用呈现浓度依赖性。流式细胞凋亡检测、JC-1免疫荧光结果提示多孔Se@SiO2纳米颗粒能抑制H2O2引起的细胞凋亡。WB显示多孔Se@SiO2纳米颗粒抑制促细胞凋亡蛋白cleavedcaspase-3和Bax的表达、促进抗细胞凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达。探究其机制，Se@SiO2纳米颗粒能够显著抑制NF-κB信号通路中p65的磷酸化。此外，Se@SiO2还抑制了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路蛋白p-JNK、p-ERK的激活。 结论：多孔Se@SiO2纳米颗粒在体外能抑制海马神经元氧化应激损伤。多孔Se@SiO2纳米颗粒通过调控MAPK和NF-κB信号通路抑制炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β等表达，并通过调节凋亡相关蛋白抑制海马神经元凋亡。 第三部分：多孔Se@SiO2纳米颗粒对全脑照射后小鼠海马组织的保护作用及机制研究 实验目的：探究多孔Se@SiO2纳米颗粒在体内的给药方法、安全使用浓度以及抗氧化应激的作用。明确多孔Se@SiO2纳米颗粒对10Gy全脑照射小鼠的海马组织是材料和方法：选取2月龄雄性ICR小鼠，将所有小鼠适应性饲养3天后随机分为3组:对照组（NC组单纯PBS注射）、照射组（10Gy照射+PBS注射），治疗组（10Gy照射+1.25mg/mlSe@SiO2注射），每组6只小鼠。使用单次全脑照射(wholebrainirradiation，WBI)10Gy造模。在照射后1天、7天检测海马组织活性氧水平；照射后1月检测海马神经发生情况；照射后3个月检测小鼠认知功能情况。 结果：腹腔注射的Se@SiO2纳米颗粒不能在海马组织中有效蓄积，因此我们选择更加精确的海马定向注射给药方式，HE切片结果提示安全给药浓度为1.25mg/ml。多孔Se@SiO2纳米颗粒可以通过上调抗氧化酶来抑制海马中的氧化应激水平。我们评估了全脑照射小鼠海马组织中炎症和凋亡的水平。结果表明，Se@SiO2纳米颗粒降低了IL-1β和TNF-α等促炎因子的表达，同时降低了clvcaspase-3的表达。我们在全脑照射后一个月检测小鼠海马齿状回（dentategyrus，DG区）新生神经元数目，结果发现Se@SiO2纳米颗粒能显著缓解辐射诱导的海马神经发生抑制，并在照射后3个月明显改善辐射诱导的认知功能障碍。 结论：在体内实验中，多孔Se@SiO2纳米颗粒具有抗氧化应激能力，能抑制海马神经元炎症和凋亡。此外，Se@SiO2纳米颗粒还能抑制了辐射引起的海马神经发生抑制，改善认知功能障碍。
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