摘要
杆状病毒是一类对节肢动物具有感染性的DNA病毒，其多用于新型病毒杀虫剂、表达载体系统、疫苗制备和药物研发等方面。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus，AcMNPV）作为杆状病毒的模式物种，是目前研究最为深入的杆状病毒，然而到目前为止，AcMNPV生命周期中产生的病毒粒子的具体形成机制仍不明确。ac146基因是Alphabaculovirus杆状病毒属极为保守的基因，敲除后无法形成感染性的病毒粒子，其在病毒粒子形成中的影响机制尚不清楚。本研究以ac146基因展开研究，探究ac146基因在病毒粒子形成中的功能。主要内容为下: 1.研究AcMNPVac146中存在的保守结构域对于病毒粒子形成的影响。通过NCBI数据库BLASTAC146氨基酸同源序列，再进行MAFFT对比分析得到ac146基因中10种保守结构域，分别为NVMLYCP(NP)、DNNISFIMPSKTNAVIVYLF(DF)，TRLVSGYENSRPININL(TL),YVISCIRAPRLYRDL(YL),YTAPLGFVVT(YT),QVWHILSVRKTFE(QE),VTGM,KDLMIMSGNVSVHFINNLQK(KK),DIDI(DIDI),LQIDNSVQL(LL)，通过PCR以及同源重组技术将缺失保守结构域基因序列的ac146基因序列连接至供体质粒pFAcT-GFP，获取重组供体质粒，之后通过Bac-to-Bac系统将重组供体质粒上的目的序列回复至ac146敲除的AcMNPVBacmid上，获取vAc146Rep(DIDIKO)-PH-GFP、vAc146Rep(NPKO)-PH-GFP、vAc146Rep(DFKO)-PH-GFP、vAc146Rep(TLKO)-PH-GFP、vAc146Rep(YLKO)-PH-GFP和vAc146Rep(YTKO)-PH-GFP六种重组病毒（其余四种由课题组前期已完成）。 接着将这6种重组病毒与ac146缺失型病毒vAcI46KO-PH-GFP、野生型病毒vAcPH-GFP和ac146回复型病毒vAc146Rep-PH-GFP一同进行转染和感染Sf9细胞实验。转染实验结果表明，六种保守结构域缺失的病毒和ac146缺失型病毒到转染后120h均未产生明显的荧光扩散现象，而野生型病毒和回复型病毒均产生荧光扩散现象，之后的感染实验结果进一步发现六种保守结构域缺失的病毒和ac146缺失型病毒在感染后120h仍未发现荧光出现，而野生型病毒和回复型病毒在感染后120h荧光已扩散至整片视野，这表明ac146中的保守结构域缺失后，未能形成具备感染性的BV病毒粒子。结合课题组之前所做的4种保守结构域结果，证明ac146中存在的10种保守结构域对于感染性BV病毒粒子的形成均是必需的。 2.AC146是否作为病毒粒子结构蛋白的鉴定。前期课题组通过对ODV进行质谱鉴定确定AC146不作为ODV病毒粒子的结构蛋白。本研究通过对纯化的BV病毒粒子进行LC-MS/MS质谱鉴定进一步鉴定AC146是否作为BV的结构蛋白存在。本研究结果共鉴定出71种BV相关蛋白，其中包括8种BV特异性蛋白，26种BV和ODV共有蛋白，并且有16种蛋白首次在BV中被鉴别出来，分别是:BRO、Ac18、ARIF-1、PNK、Ac44、TRAX-like、ETM、MTase、HE65、Ac120、PK-2、P94、P35、EXON0、PE38、Ac154。但是本次鉴定结果未检测到AC146蛋白的存在，结合前期ODV的鉴定结果，AC146很可能不作为两种病毒粒子的结构蛋白。鉴于质谱技术的灵敏性原因，AC146是否为BV病毒粒子的结构蛋白仍有待商榷。总之本次鉴定结果丰富了BV病毒粒子结构蛋白的数量，有利于我们更好的了解BV病毒粒子蛋白成分的组成。 3.研究AC146是否作为病毒粒子形成相关基因的转录调控因子。基于前期课题组对ac146起始密码子ATG进行突变实验证明AC146是作为蛋白的形式在病毒粒子形成中发挥作用，并且通过电镜未在ac146缺失的转染细胞的细胞核中发现核衣壳的存在。因此本研究通过RT-PCR来鉴定ac146缺失后核衣壳相关蛋白基因以及与ac146存在相互作用的蛋白基因表达情况，以揭示AC146蛋白是否拥有转录调控的功能。首先选取了vp39、38k、vlf-1、vp1054、p6.9、p10和polh七种影响核衣壳组装的基因以及BV主要包膜蛋白编码基因gp64，同时还有两种与AC146蛋白互作的两种蛋白编码基因ac103和ac141。之后将野生型病毒与ac146缺失型病毒以相同条件转染Sf9细胞，在36h收集细胞并提取细胞总RNA，通过RT-PCR检测十种基因表达水平。结果显示，ac146缺失后vp39、38k、vlf-1、vp1054、p6.9、p10、polh、gp64和ac141九种基因的表达水平与野生型一致，表明AC146并不作为它们的转录调控因子在病毒粒子形成中发挥作用。而ac103在ac146缺失后，其转录水平明显上升，表明AC146会抑制ac103基因的表达。
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