摘要
研究背景 葡萄膜黑色素瘤(uvealmelanoma,UM)是成年人眼部最常见的恶性肿瘤，约占所有眼部肿瘤的85％[1]。葡萄膜黑色素瘤恶性程度高，在患者体内会发生转移，其中以肝脏转移最常见[2]。由于缺乏有效的治疗手段，该病患者的平均存活期较短，只有2-8月左右[3]。 GNAQ和GNA11是UM最常见的驱动突变基因[4]。GNAQ/11突变导致编码的Gaq/11蛋白处于持续活化状态，激活下游YAP信号通路，驱动了UM的发生发展[5]。GNAQ/11突变UM细胞的生存依赖YAP的转录活性。YAP作为一个转录共激活因子，主要通过结合转录因子TEAD蛋白来调控基因的转录[6]。 溴结构域和超末端(bromodomainandextraterminaldomain，BET)家族包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT，是调节基因表达的表观遗传阅读器。BET蛋白均有2个高度保守的溴结构域(bromodomains，BRDs)，该结构域可识别并结合组蛋白或其他蛋白上的乙酰化赖氨酸，并进一步招募其他蛋白比如转录因子，调控基因转录表达。而BET抑制剂则是通过竞争BET蛋白的溴结构域，抑制其与乙酰化组蛋白结合，从而抑制了BET蛋白对转录的调控[7]。近年来有研究发现，BET抑制剂抑制了GNAQ/11突变UM细胞的生长[8]。但是，BET抑制剂对GNAQ/11突变UM细胞的抑制作用的分子机制尚未阐明。 研究目的 本研究拟以已知结论为基础，即GNAQ/11突变细胞对BET抑制剂更为敏感以及GNAQ/11突变UM细胞依赖YAP转录活性生存，考察BET抑制剂是否通过Hippo-YAP通路抑制GNAQ突变UM细胞，探讨BET抑制剂在斑马鱼胚移植瘤模型和裸鼠皮下移植瘤模型中对GNAQ突变UM细胞的抗肿瘤作用，为推动BET抑制剂成为GNAQ突变UM患者靶向治疗药物提供科学依据。 研究方法 1.MTT法研究不同突变背景UM细胞对BET抑制剂的敏感性。 2.CRISPR/Cas9技术和修复模板构建GNAQ突变的同基因型细胞模型（基因敲入）。 3.WesternBlot研究BET抑制剂作用后细胞LATS1/2、p-YAP和YAP的蛋白水平。 4.Rescue实验验证YAP与GNAQ突变UM细胞对BET抑制剂高度敏感的关系。 5.双荧光素酶法、qPCR、CRISPR/Cas9技术、Co-IP、ChIP-qPCR和WesternBlot探索GNAQ突变UM细胞对BET抑制剂敏感的分子机制。 6.在斑马鱼胚移植瘤模型和裸鼠皮下移植瘤模型中研究BET抑制剂的体内抗肿瘤活性。 研究结果 1.GNAQ突变UM细胞对BET抑制剂高度敏感。 2.BET抑制剂OTX015或敲低BRD4能明显抑制YAP启动子荧光素酶活性并减少YAPmRNA水平。 3.BET抑制剂OTX015阻断了BRD4和YAP结合，并减少了YAP结合下游靶基因CTGF和CYR61启动子。 4.敲低YAP减少了BRD4启动子荧光素酶活性和蛋白水平。 5.斑马鱼胚移植瘤模型表明BET抑制剂减少了GNAQ突变UM细胞的迁移;裸鼠皮下移植瘤模型显示BET抑制剂抑制了GNAQ突变UM移植瘤的生长。 研究结论: 1.GNAQ突变导致细胞对BET抑制剂敏感。 2.BET抑制剂不通过Hippo通路而是靶向BRD4抑制YAP的表达。 3.BET抑制剂阻断BRD4和YAP结合，抑制YAP对下游靶基因的促转录活性。 4.BET抑制剂通过抑制YAP减少了BRD4基因的表达。 5.BET抑制剂对GNAQ突变UM移植瘤具有抗迁移和抗生长的作用。
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