摘要
二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase，DHFR，EC1.5.1.3)是一类将二氢叶酸催化生成四氢叶酸(Tetrahydrofolate，THF)的还原酶。四氢叶酸在核酸代谢中参与DNA和RNA的合成、氨基酸代谢等反应，对生物体细胞增殖、蛋白质的合成等反应有重要作用。作为核酸代谢关键酶的二氢叶酸还原酶被广泛用作包括抗疟疾、抗病毒、抗菌和抗癌等药物分子的靶标蛋白，对其表达水平和抑制效果的研究具有重要意义。 黄酮类化合物(Flavonoids)广泛存在于植物中，是植物体内的次生代谢产物，具有药性温和、毒副作用低等特点，是二氢叶酸还原酶的一类重要靶向药物。研究黄酮类化合物对二氢叶酸还原酶的抑制能力及作用方式对该类化合物的靶向药设计具有重要作用。本论文分别以来源于大肠杆菌、立枯丝核杆菌、人类的二氢叶酸还原酶为研究对象。相关实验工作如下: 第一部分，二氢叶酸还原酶表达纯化体系的研究。首先，采用控制变量法对蛋白表达的诱导剂浓度、诱导时间以及诱导温度进行优化。最终得到三种蛋白质的最佳诱导表达条件，即大肠杆菌二氢叶酸还原酶的最适诱导表达条件是在0.1mMIPTG，22℃，200rpm条件下培养19h;立枯丝核杆菌二氢叶酸还原酶的最适诱导表达条件是在0.1mMIPTG，24℃，200rpm条件下培养20h;人类二氢叶酸还原酶的最适诱导表达条件是在0.1mMIPTG，26℃，200rpm条件下培养14h。其次，进行酶活测试研究了促融蛋白NusA对立枯丝核杆菌二氢叶酸还原酶和人类二氢叶酸还原酶酶活与热稳定性的影响。结果表明，促融蛋白NusA对两种二氢叶酸还原酶的酶活与热稳定性均有负作用。第三，通过同源重组在人类二氢叶酸还原酶质粒的TEV酶切位点与目的蛋白之间添加三对甘氨酸和丝氨酸随后进行酶切效率对比。结果表明，在相同酶切条件下，添加三对甘氨酸和丝氨酸后的人类二氢叶酸还原酶的酶切效率从58.6％提升到91.4％。 第二部分，黄酮类化合物的筛选与抑制机理分析。首先，使用模拟软件与抑制测试实验来筛选黄酮类化合物库，最终获得三个IC50值在200μM以内的黄酮化合物，其中α-萘黄酮IC50值为131.1μM、香叶木素IC50值为158.1μM、甘草素IC50值为43.5μM。其次，利用Ligplot和PyMOL对AutodockVina输出的分子对接文件进行可视化分析。结果表明甘草素与蛋白质的Asp21和Glu30形成两个长度分别为3.12(A)和2.76(A)的氢键，与辅酶NADPH形成一个2.85(A)的氢键。化合物与蛋白质的Δsp21、Glu30、Phe34、Phe31、Ser60、Pro61、Leu22、Ile60以及NADPH均存在疏水相互作用;香叶木素与蛋白质的Val115、Ile7、Glu30形成了3个长度分别为2.75(A)、3.01(A)、2.94(A)的氢键。化合物与蛋白质的Val115、Ile7、Glu30、Phe34、Phe31、Pro61、Leu22、Asn64、Ala9、Val8以及NADPH均存在疏水相互作用;α-萘黄酮与蛋白质的Phe31、Leu22、Leu27、Ile60、Val15、Ile7、Phe34、Val8、Ala9、Glu30以及NADPH存在疏水相互作用。 本文首先通过对二氢叶酸还原酶表达体系的优化，获得了三个高纯度的二氢叶酸还原酶，然后用分子模拟软件对黄酮类化合物进行了筛选并研究了黄酮类化合物对人类二氢叶酸还原酶的抑制效果，本论文研究结果将为后续以人类二氢叶酸还原酶为靶标的药物的设计提供依据。
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