摘要
大豆[Glycinemax(L.)Merr.]起源于中国，在我国已有五千多年的栽培历史，是豆科植物中蛋白质丰富且廉价的粮食作物和油料作物。大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus，SMV)广泛存在于全球的大豆产区，由其引发的病毒病害能够导致大豆严重减产以及品质恶化。培育抗病大豆品种是防治SMV病害的极为有效的方式，由于SMV株系划分的复杂性和多样性，且大豆对SMV的抗性具有株系专化性，运用传统的育种方法很难快速培育出对SMV具有广谱抗性的大豆品种。转基因育种方法的发展，为培育抗大豆花叶病毒大豆品种提供了新的可能，这也为SMV的有效防治起到了关键的作用。 大豆真核翻译起始因子eIF4E(eukaryotictranslationinitiationfactor4E)是普遍存在于真核生物体内的隐性抗病基因，也是多种RNA病毒完成侵染过程的必需元件。本实验室通过构建RNAi载体，将eIF4E干扰片段导入受体材料天隆一号大豆基因组中，通过特异性沉默eIF4E基因，阻断eIF4E与SMV元件的结合，进而达到抵抗SMV的目的。前人对构建的转基因材料eIF4Ei-TL1的T3和T4代进行广谱抗病鉴定，表明T3和T4代材料具有对马铃薯Y病毒属的多种病毒的广谱抗病性，但并未全部达到高度抗病(HR)水平。为了选择后代中的高度抗病的转基因家系及单株，故进一步对T6代和T7代进行抗病性鉴定并对T7代抗病性及农艺性状优良的家系进行选择。 通过PCR检测、Southern杂交检测、Western杂交检测、Elisa试剂盒检测、PAT/bar试纸条检测、除草剂涂抹以及侧翼序列分析方法检测后代家系中保证抗病的目的基因是否存在以及能否稳定遗传。其中PCR检测结果显示T5-T7代转基因材料中目的基因能够稳定遗传;Southern检测结果显示T5-T7代eIF4Ei-TL1植株的DNA与Bar探针杂交均有条带出现且大小符合预期，表明三代材料中Bar基因能够稳定遗传;Western与Elisa试剂盒检测结果表明转基因材料根、茎、叶、花、荚、种子中均有BAR蛋白表达，且根中表达最多为149.17ng/g，叶次之，种子中表达最少为5.07ng/g;;PAT/bar试纸条检测显示T5-T7代eIF4Ei-TL1植株均出现对照线和检测线，而受体植株只有对照线，说明Bar基因成功表达成蛋白质;除草剂涂抹实验结果表明目的基因稳定存在于T5和T6代大豆基因组中;侧翼序列分析实验表明转eIF4Ei基因的外源T-DNA插入位置位于基因组第11号染色体的4906903位点，插入方向为正向单拷贝插入。基于以上结果，推测目的基因已经成功导入大豆基因组中并稳定遗传。 对T6代转基因材料接种马铃薯Y病毒属的SMV的SC3、SC7、SC15、SC18株系和重组型SMV病毒(SMV-R)以及菜豆普通花叶病毒(BCMV)、西瓜花叶病毒(WMV)、菜豆荚斑驳病毒(BPMV)进行鉴定，结果表明受体对照品种天隆一号所有植株均为中度抗病(MR)，而转基因材料高度抗病(HR)植株占鉴定株数的95.36％，其余均为中度抗病。在对T7代15个家系材料接种SMV四个株系以及BCMV和WMV的鉴定中，受体对照品种天隆一号均为中度抗病(MR)，而转基因材料高度抗病(HR)植株占鉴定株数的97.14％，其余均为中度抗病。取样接种SMV后15天和30天的叶片进行DAS-ELISA检测，发现转基因材料中的病毒积累量相比受体对照显著下降。对菜豆荚斑驳病毒(BPMV)的抗病性鉴定表明受体材料与转基因材料均为感病(S)。通过对T7代材料的抗病性鉴定最终获得具有高度抗病(HR)水平的8个转基因家系以及180个转基因单株，共计408个转基因单株。 本研究对接种PBS的天隆一号（对照）和T7代转基因材料收获前的叶形、花色、生长习性、结荚习性、株型以及收获后的株高、底荚高、分枝数、主茎节数、单株荚数、单株粒数、百粒重以及单株粒重等农艺性状进行调查和分析，发现对照和转基因两者之间株高有一定的差异，其它性状均无明显差异。对接种SMV四个株系SC3、SC7、SC15、SC18以及另外两种马铃薯Y病毒属的病毒BCMV和WMV的15个转基因家系之间的农艺性状进行比较，发现接种同一病毒的不同转基因家系间的农艺性状也有不同。对接种病毒的T7代转基因家系以及天隆一号进行农艺性状比较，发现接种病毒后的天隆一号表现为株高降低，单株荚数、单株粒数减少，百粒重和单株粒重降低。营养成分分析表明，T7代转基因材料种子中平均蛋白质含量以及油脂含量分别为43.28％和21.20％，与天隆一号相比无明显差异，说明转基因对大豆的蛋白质及脂肪含量没有显著差异。
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