摘要
芒柄花素(Formononetin,FMN)，是一种异黄酮类化合物，主要来源于红车轴草、黄芪、黑升麻等草药的根中，具有抗炎、抗肿瘤、调节血脂代谢、舒张血管、抗病毒、保护神经等多种药理作用。近年来的研究发现芒柄花素在抗肿瘤方面潜能较大，但是芒柄花素诱导肿瘤细胞凋亡与ROS的相关性的机制研究尚未明确报道。因此本论文以体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞为研究对象对此机制进行探讨，为抗肿瘤药物的研发提供理论依据。 方法:(1)采用MTT法检测芒柄花素人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响;(2)采用AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术(FCM)检测芒柄花素及其联合抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡率的影响;(3)采用DCFH-DA荧光标记检测芒柄花素及其联合NAC对MCF-7细胞内ROS水平的影响;(4)采用Rhodamine123探针染色分析芒柄花素及其联合NAC对MCF-7细胞线粒体膜电位(MMP)的影响;(5)采用Westemblot实验分析芒柄花素及其联合NAC对Bcl-2、Bax、Caspase-3、JNK及P-JNK蛋白表达水平的影响;(6)采用分光光度法分别检测人乳腺癌MCF-7细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力。 结果:(1)芒柄花素能显著抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖，增殖抑制率随剂量的增加而升高，48h的IC50值为79.1μmol/L。设定低剂量组、中较量组、高剂量组的芒柄花素浓度分别为39.5μmol/L、79μmol/L、158μmol/L，阳性对照组设定为2.4μmol/L表阿霉素。抑制剂组设定为终浓度10mmol/L的抗氧化剂NAC联合中剂量的芒柄花素，以与中剂量组进行对照。(2)各组的凋亡率分别为:空白对照组为(2.78±0.62)％，阳性对照组为(34.85±3.89)％，低剂量组为(5.43±0.32)％，中剂量组为(17.46±1.69)％，高剂量组为(39.55±4.31)％，抑制剂组为(4.60±0.87)％。凋亡率随芒柄花素剂量的增加而升高，抑制剂组的凋亡率显著低于中剂量组。可推测芒柄花素诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡与升高ROS水平有关。(3)ROS水平随着芒柄花素给药剂量的增加而升高，抑制剂组的ROS水平显著低于中剂量组(P＜0.01)，表明芒柄花素能升高MCF-7细胞内ROS水平。(4)随着芒柄花素给药剂量的增加，MMP逐渐降低，与对照组比较具有显著性差异(P＜0.01);抑制剂组的线粒体膜电位显著高于中剂量组(P＜0.01，表明表明芒柄花素能够诱导MCF-7细胞凋亡与降低细胞线粒体膜电位有关。(5)芒柄花素能下调MCF-7细胞内Bcl-2蛋白表达水平，上调Bax、cleavedcaspase-3、P-JNK蛋白表达水平，芒柄花素联合NAC组与之相反，此作用与ROS的升高有关。(6)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活力随着芒柄花素剂量的增加而降低，表明芒柄花素能够抑制MCF-7细胞内抗氧化酶的活性。 结论:芒柄花素能诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡，此作用与升高ROS有关。其作用机制可能是通过抑制MCF-7细胞内抗氧化酶的活力，升高ROS水平，激活JNK信号通路，增加Bax/Bcl-2表达比例，致使线粒体损伤，线粒体膜电位下降，最终激活caspase-3，引起MCF-7细胞凋亡。
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