摘要
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是目前国内外用于治疗癌症最具有前景的方法，它在复发难治性急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)中的疗效令人振奋。CD19抗原是CAR-T细胞疗法治疗B系血液瘤研究中最常见的靶点。如今，自体CD19CART细胞在患者体内反应趋于稳定，为了使其能够让更多患者获得治疗，开发通用型CD19CAR-T细胞是关键突破口之一。为了实现该策略，需要消除同种异体CART细胞上的T细胞受体(TCR)以避免移植物抗宿主病(GVHD)和主要组织相容性复合物(MHC)，从而使CART细胞的免疫原性最小化。在相关制备通用型CD19CAR-T细胞研究中发现，多基因敲除效率、基因敲除安全性及功能变化依然是不可忽视的问题。人类MHC分子包含HLAⅠ类分子与HLAⅡ类分子，大部分研究者认为TCR与HLAⅠ类分子是导致CART细胞治疗中免疫排斥的关键，HLAⅡ类分子的存在对治疗过程无太大影响。虽然这种情况下理论上HLAⅡ类分子的存在不会发生排斥反应，但至今没有充分的数据支持这一说法，因此进一步研究将HLA分子全部消除对CAR-T细胞的影响具有很大意义。 本课题利用一种技术上较成熟、操作简单的基因编辑技术-CRISPR/Cas9，对靶向CD19的CAR-T细胞实现多基因敲除，获得不表达TCR、HLAⅠ类分子、HLAⅡ类分子三大免疫排斥相关蛋白的CD19CART细胞;并采用体外杀伤与ELISA因子检测的方式对其功能进行验证。首先，通过电转LV-GFP质粒快速筛选出电转PBMC使用的最佳程序。然后，我们设计了若干条分别靶向TCR、B2M(HLAⅠ类分子共同亚基)和CIITA(HLAⅡ类分子转录调控因子)基因的sgRNA，分别筛选出最优序列，并将它们构建在同一个载体上，即一个可用于同时敲除TCR、HLAⅠ类分子与HLAⅡ类分子的敲除质粒(PX330A-1X3-sgTRAC-1-sgB2M-3-sgCIITA2)。接着，由本实验室此前设计并保存的CD19CAR慢病毒感染PBMC后进行敲除质粒电转染，通过流式分选技术获得HLAⅠnullHLAⅡnullTCRnullCD19CAR-T细胞。在此过程中，进行了一系列电转多基因敲除质粒转染效率优化实验。最后，为验证多基因敲除对CAR-T细胞功能是否有影响，我们从细胞杀伤肿瘤的能力与杀伤后因子分泌情况两方面开展试验。将获得的细胞设置不同效靶比，对CD19抗原阳性表达细胞Raji与阴性细胞K562进行体外杀伤实验，分析杀伤结果并取杀伤后细胞上清检测IFN-γ因子分泌情况。以上系列实验结果显示，本研究使用的gRNA序列可成功切割基因组打靶位点(T7EⅠ酶切与基因组测序鉴定)，且均未出现我们顾虑的脱靶效应(对预测脱靶位点区域进行测序)。本研究最终获得的HLAⅠnullHLAⅡnullTCRnullCD19CAR-T细胞可在体外成功杀伤Raji细胞并释放细胞因子IFN-γ，而对K562细胞未见明显杀伤作用且未检出因子分泌。 综上所述，我们成功建立了一种快速经济用于制备通用型CD19CAR-T细胞的方法，并获得了可用于体外研究的通用型CD19CAR-T细胞，以上研究成果不仅为通用型CD19CAR-T细胞新药开发开辟了新道路，同时也为通用型CAR-T细胞的开发提供了理论依据与实践基础。
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