摘要
研究背景: 动脉粥样硬化是一种由巨噬细胞主导的，血管的慢性炎症性疾病。在动脉粥样硬化的进展过程中，巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块中不断积累。有诸多因素造成了巨噬细胞在斑块中的不断积累，包括单核细胞募集增加，巨噬细胞迁出减少，凋亡廓清受阻以及局部增殖增加等。一般认为，正常的巨噬细胞在斑块当中，通过吞噬修饰的脂蛋白成分（如氧化修饰的低密度脂蛋白，OxLDL），外运胆固醇，吞噬组织内的细胞残骸，启始组织修复，在血管壁微环境的内稳态维持中发挥重要作用。然而，各种病理性因素（包括高脂蛋白血症、持续组织损伤等）的持续刺激，可能导致巨噬细胞功能紊乱，主要表现为巨噬细胞炎症反应的激活，导致局部组织损伤和疾病进展。巨噬细胞的炎症反应会直接抑制巨噬细胞的胆固醇外运和凋亡坏死物质廓清的能力，造成细胞残骸在细胞外基质不断积累形成坏死内核。另外，巨噬细胞分泌的各种炎症因子可加重局部的组织损伤，进而扩大炎症反应，形成恶性循环。一系列研究表明，干预巨噬细胞炎症激活的关键通路（如IκB/NFκB、MAPKs等通路），对动脉粥样硬化的发展具有显著影响。由此可见，巨噬细胞介导的炎症反应在动脉粥样硬化发生发展中发挥关键作用。由于斑块中巨噬细胞的功能高度复杂，许多心血管危险因素对于巨噬细胞的影响尚不清楚。 甲状腺功能减退症（甲减）在临床上常伴高胆固醇血症和心血管疾病。传统观点认为，上述相关性是甲状腺素水平降低伴随的代谢异常导致的。然而在甲状腺素水平维持在正常范围，而仅有促甲状腺激素(ThyroidStimulatingHormone，TSH)升高的亚临床甲状腺功能减退症（亚甲减）患者，在临床上也观察到了高胆固醇血症和心血管疾病风险升高，提示TSH可能在这些疾病中发挥着独立于调控甲状腺功能以外的作用。 TSH是一种由垂体合成和分泌的糖蛋白类激素，通过结合表达于甲状腺细胞上的TSH受体(TSHR)促进甲状腺合成和分泌甲状腺素，在下丘脑-垂体-甲状腺轴中发挥重要作用。TSHR是一种G蛋白偶联受体，其胞内信号转导主要由其所偶联的G蛋白介导。G蛋白由α、β、γ三个亚基组成，其下游信号主要由其α亚基（主要包括Gαs，Gαi，Gαq/11/15，Gα12/13等四大类）所决定。现在发现，TSHR的表达并非局限于甲状腺细胞。在甲状腺以外的一系列组织和细胞，如肝细胞、脂肪细胞、破骨细胞等，均有TSHR的表达。研究表明，TSH通过作用于这些甲状腺外的TSHR，可发挥各种组织特异的调控功能，如调节肝脏胆固醇代谢，影响脂肪细胞的发育和甘油三酯合成，抑制破骨细胞分化等。值得一提的是，TSHR在巨噬细胞、平滑肌和内皮细胞，三种在动脉粥样硬化中发挥重要作用的关键细胞中，也均有表达。因此我们考虑，在亚甲减患者中，升高的TSH有可能能通过作用于动脉粥样硬化斑块中的这些细胞，影响疾病的进程。 为观察TSH在动脉粥样硬化中的作用，我们课题组前期通过将ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠与Tshr+/-小鼠杂交，获得ApoE-/-Tshr-/-小鼠，及其同窝对照ApoE-/-Tshr+/+小鼠。由于ApoE-/-Tshr-/-小鼠TSHR缺陷，自身不能产生甲状腺激素，我们在饲料中添加甲状腺粉末，使这些小鼠血清甲状腺激素处于正常水平。我们发现，与对照小鼠相比，ApoE-/-Tshr-/-小鼠在血脂水平和甲状腺功能无显著改变的情况下，动脉粥样硬化斑块面积明显减少。这提示TSH在动脉粥样硬化的发展中对血管壁中的细胞的调控作用，能直接影响动脉粥样硬化的进展。对斑块中的成分进行分析发现，ApoE-/-Tshr-/-小鼠斑块中的平滑肌和胶原成分与对照相比并无明显差异，但其斑块中的巨噬细胞数量明显减少，主动脉中一系列炎症标记物水平也出现明显下降。进一步体外研究表明，TSH刺激能促进巨噬细胞IL-6、TNF-α等促炎因子的表达。 基于以上观察，我们提出猜想，TSH有可能能直接作用于斑块中的巨噬细胞，促进动脉粥样硬化。为检验此猜想是否成立，本课题首先验证了斑块中TSH与TSHR的存在;进而通过相关体外实验，探讨了TSH影响斑块中巨噬细胞数量的细胞、分子机制，以及TSH激活巨噬细胞炎症反应的相关信号通路;最后我们还通过构建髓系Tshr敲除的ApoE-/-小鼠，在体内验证了TSH对巨噬细胞的调控作用在动脉粥样硬化当中的病理生理意义。本课题深入研究了诸多临床研究中所观察到的TSH与动脉粥样硬化的相关性的具体机制，为甲状腺疾病的诊疗与心血管疾病的预防提供更多的理论依据。 研究目的: 1.检测斑块中TSH的水平及斑块巨噬细胞TSHR的表达 2.体外探讨TSH对巨噬细胞调控作用 3.体内验证TSH对巨噬细胞调控作用在动脉粥样硬化当中的病理生理意义 4.探讨TSH激活巨噬细胞炎症反应的机制 研究方法: 1.通过主动脉根部冰冻切片的免疫组化观察西方饮食12周ApoE-/-小鼠主动脉斑块中TSH的存在与分布;通过全主动脉匀浆的蛋白质印记（WesternBlotting，WB）分析，比较野生型C57小鼠、普食的ApoE-/-小鼠及已接受西方饮食的ApoE-/-小鼠的主动脉蛋白中TSH的水平，了解主动脉中TSH含量随动脉粥样硬化进展的变化。 2.通过ApoE-/-小鼠主动脉根部切片的TSHR及巨噬细胞标记物MOMA-2的双色免疫荧光染色，观察动脉粥样硬化斑块中TSHR与的巨噬细胞的分布关系，了解斑块内巨噬细胞是否有TSHR表达。 3.小鼠骨髓原代细胞体外诱导分化7天得到小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BoneMarrowDerivedMacrophages，BMDM)用于体外TSH刺激实验，观察TSH对巨噬细胞炎症标志物表达，凋亡的影响，BMDM的培养基上清用于transwell实验;小鼠骨髓单核细胞及外周血单核细胞通过磁分选提纯获得;腹腔注射淀粉溶液3天后灌洗腹腔获取小鼠腹腔原代巨噬细胞，种于细胞爬片，用于免疫荧光染色;RAW264.7按ATCC描述进行复苏、维持、传代，用于信号通路研究。 4.通过qPCR检测TSH对巨噬细胞应对OxLDL刺激时的一系列炎症标志物（包括Tnf-α、Il-6、Nos2、Ccl2、Arg1、Pparg、Abca1等）的影响:BMDMs加入0.5ng/mlTSH（或等体积PBS作为对照）预处理24小时后加入25μg/mlOxLDL，继续孵育24小时后提取细胞RNA，反转录后以qPCR检测各个标志物的水平。 5.通过transwell小室实验了解TSH处理后的巨噬细胞对单核细胞的吸引作用:BMDMs加入0.5ng/mlTSH（或等体积PBS作为对照）及25μg/mlOxLDL孵育12小时后，收集培养基上清加入transwell小室下室;各孔上室加入2×105个新鲜获取的骨髓单核细胞，37度孵育3小时后，观察，拍照，计数各孔迁移到下室中的单核细胞数量。 6.通过qPCR检测Tshr+/+与Tshr-/-来源的BMDMs分化的第0，1，3，5，7天时其巨噬细胞分化标志物的表达水平，了解Tshr敲除是否影响巨噬细胞的分化。通过流式细胞计数（FlowCytometry,FCM）检测骨髓单核细胞在含或不含0.5ng/mlTSH的培养基中24及48小时后F4/80的表达水平，了解TSH对于单核细胞成熟的影响。 7.通过FCM检测TSH对OxLDL诱导的巨噬细胞凋亡的影响:BMDMs加入0.5ng/mlTSH（或等体积PBS作为对照）处理24小时后，加入80μg/mlOxLDL继续刺激24小时，随后以PI+AnnexinⅤ凋亡检测试剂盒染色，上机分析。 8.通过构建髓系特异Tshr敲除的ApoE-/-小鼠，检验巨噬细胞的TSHR在斑块形成中的病理生理意义:通过将Tshrflox/flox小鼠与LyzCre+mice（髓系特异CRE表达小鼠品系）杂交并筛选获得髓系特异Tshr敲除小鼠（LyzCre+Tshrflox/flox），进而与ApoE-/-小鼠杂交并筛选，获得LyzM-cre+Tshrflox/floxApoE-/-(TSHRMKO)小鼠及其同窝对照LyzM-cre+Tshrwt/wtApoE-/-(LC)，六周后给予西方饮食喂养，12周或16周后，处死小鼠获取抗凝血(50μl)、血清、主动脉根部、主动脉。 9.通过ELISA检测TSHRMKO或LC小鼠血清中IL-6中及CCL2水平了解其全身炎症水平。 10.通过放射免疫法检测小鼠血清中总T3，总T4水平。 11.通过OlympusAU5400系统检测小鼠血清中总胆固醇，高密度及低密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯水平。 12.通过对小鼠外周血免疫标记后流式检测对其白细胞进行分型计数。 13.通过小鼠主动脉大体油红染色、小鼠主动脉根部冰冻切片的H&E及油红染色检测全主动脉及主动脉根部斑块面积;通过主动脉根部切片的免疫组化检测斑块中巨噬细胞标记物(F4/80)及炎症因子(CCL2、IL-6)的表达水平。 14.动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的凋亡速率及增殖情况，分别通过主动脉根部冰冻切片的F4/80免疫荧光复染TdT介导的dUTP缺口末端标记(TdT-mediateddUTPnickendlabeling，TUNEL)，以及Ki67免疫组化染色进行观察。 15.通过对小鼠主动脉的FCM分析观察TSHRMKO或LC小鼠主动脉内CD45+白细胞，巨噬细胞、单核细胞的数量和比例的变化。 16.通过CFSE标记单核细胞过继转移入已接受西方饮食的TSHRMKO或LC小鼠体内，24小时后提取主动脉行FCM分析检测单核细胞进入斑块速率。 17.通过对已接受西方饮食的TSHRMKO或LC小鼠静脉注射荧光微球标记外周血单核细胞，5天后处死小鼠，获取主动脉根部，连续切片后，在显微镜下对进入斑块内的微球计数，评估单核细胞进入斑块的速度;处死小鼠时获取外周血行单核细胞的标记CD115染色，以FCM评估标记的效率及特异性。 18.体外用1ng/mlTSH刺激或等体积PBS或50ng/mlLPS作为阴性对照及阳性对照，刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞，30分钟后固定细胞行NFκBp65免疫荧光染色观察TSH对p65核转位的影响。 19.体外以不同浓度的TSH刺激RAW264.7小鼠单核-巨噬细胞系不同时间，提取全蛋白或核/浆蛋白，以WB检测IκBα及各MAPKs的总蛋白与磷酸化水平，了解TSH对于这些通路的激活作用。 20.以siRNA或相应的小分子抑制剂阻断各通路上关键分子(Tshr，Gαs，Gαi,Gαq，Gα11，Gα15，Gα12，Gα13)，后以1ng/ml的TSH刺激RAW264.7细胞，30分钟后提取全蛋白检测IκB/NFκB和MAPKs通路的激活情况，了解在巨噬细胞中介导TSH的促炎作用的关键G蛋白类型及其下游信号通路。 结果: 1.斑块中存在TSH，斑块巨噬细胞上存在TSHR表达 西方饮食喂养的ApoE-/-小鼠主动脉根部切片免疫组化染色显示，TSH在各期斑块中均有存在。蛋白质印记比较野生型C57小鼠与普食、西方饮食喂养的ApoE-/-小鼠主动脉组织匀浆中TSH含量，发现随动脉粥样硬化的进展，主动脉中TSH水平不断上升。ApoE-/-小鼠主动脉根部切片的TSHR+MOMA-2双色免疫荧光显示，动脉粥样硬化斑块中存在TSHR阳性区域，与巨噬细胞标记MOMA-2阳性区域存在重合，提示斑块巨噬细胞表达TSHR。 2.体外TSH预处理能增强巨噬细胞应对OxLDL刺激时的炎症因子表达，增加单核细胞向巨噬细胞的趋化 qPCR显示，与PBS相比，0.5ng/mlTSH预处理24小时能显著升高Tshr野生型巨噬细胞应对OxLDL刺激后一系列急性炎症标志物如Tnf-α、Il-6、Nos2、Ccl2的表达，并降低Arg1、Pparg和Abca1等一系列在发挥抗炎作用的分子的表达（P均＜0.05）。Transwell小室趋化实验显示，与PBS相比，TSH处理后的巨噬细胞的培养基，对单核细胞的吸引作用显著上升（约2.2倍，P＜0.01）。上述作用均能被巨噬细胞Tshr敲除阻断。 3.体外TSH刺激对巨噬细胞的分化及OxLDL诱导的凋亡无明显影响 qPCR显示，Tshr+/+与Tshr-/-的骨髓细胞在体外向BMDM分化的第0，1，3，5，7天，一系列分化标记物F4/80，Lyz1/2,MerTK,Nr4α1等的表达量无明显差异(P＞0.05)。FCM显示，与对照相比，0.5ng/mlTSH孵育下的单核细胞的成熟巨噬细胞标记F4/80的水平并无显著差异(P＞0.05)。另外，FCM显示，与对照相比，TSH预处理对于OxLDL诱导的巨噬细胞的凋亡的速率并无显著影响(P＞0.05)。这提示单核细胞成熟或者巨噬细胞凋亡速率的改变应该不是影响Tshr-/-小鼠斑块中巨噬细胞数量的主要因素。 4.髓系Tshr敲除能减少斑块内巨噬细胞数量，抑制斑块内炎症，延缓动脉粥样硬化 与同窝对照(LC)相比，髓系Tshr敲除(TSHRMKO)小鼠的甲状腺功能、血脂、及外周血各种白细胞的数量并无明显改变(P＞0.05)，然而其血清IL-6、CCL2水平显著下降(P＜0.05)。全主动脉大体油红染色及主动脉根部切片油红、H&E染色显示，在西方饮食喂养12周及16周后，TSHRMKO小鼠的动脉粥样硬化斑块面积显著缩小(vsLC:P＜0.01)。主动脉根部免疫组化显示，TSHRMKO小鼠斑块内F4/80、CCL2、IL-6水平均明显下降(vsLC:P＜0.05)，提示髓系Tshr敲除能减少斑块内巨噬细胞数量，抑制血管壁炎症。 5.髓系Tshr敲除通过抑制单核细胞向斑块募集减少斑块中巨噬细胞数量 全主动脉FCM显示，与同窝对照相比，在TSHRMKO小鼠的主动脉中，CD45+细胞、CD64+巨噬细胞以及新鲜募集的CD11b+CD64loLy6Chi单核细胞均明显减少(vsLC:CD45+及巨噬细胞:P＜0.05;单核细胞:P＜0.01)。CFSE标记的单核细胞的过继转移实验显示，标记的单核细胞进入TSHRMKO小鼠主动脉的数量明显降低(vsLC:P＜0.01)。在体内荧光微球追踪实验中，虽然荧光微球对TSHRMKO小鼠的单核细胞的标记效率与特异性与对照相当，然而其主动脉根部微球数量较对照组明显减少(vsLC:P＜0.001)。这些结果提示髓系Tshr敲除通过抑制单核细胞向斑块募集。另一方面，主动脉根部切片的TUNEL染色显示，TSHRMKO小鼠斑块中的凋亡无明显变化(vsLC:P＞0.05);主动脉根部切片Ki67染色显示，TSHRMKO小鼠斑块中的增殖出现上升（vsLC:12周，P＜0.01;16周:P＜0.05），这提示凋亡和增殖均并非造成TSHRMKO小鼠斑块中巨噬细胞数量减少的主要机制。 6.TSH通过Gα15/PLCβ/PKCs/IκB/NFκB及Gα13/RhoGTPase/ERK-p38通路促进巨噬细胞炎症 IκB/NFκB和MAPKs(经典亚型包括ERKs、JNKs(p46/p54)和p38）在巨噬细胞的炎症激活中发挥关键作用。免疫荧光显示，1ng/mlTSH刺激腹腔原代巨噬细胞30分钟，能促进炎症激活的关键转录因子NFκBp65的入核。蛋白质印记显示，TSH刺激RAW264.7细胞能量效(0.2、0.5、1ng/ml)、时效(15、30、60min)性地促进IκBα的磷酸化和降解、ERK1/2、JNKs(p46/p54)和p38α的磷酸化。上述作用均可被TshrsiRNA所阻断。通过WB对通路进行进一步研究发现，NF449（Gαs阻断剂）及百日咳毒素（pertussistoxin，PTX，Gαi抑制剂）均不能抑制TSH所诱导的IκB、ERK1/2、p38或JNK的磷酸化。而U73122（PLC抑制剂，作用于Gαq/11/15下游）能抑制TSH引起的IκB磷酸化降解和ERK1/2的磷酸化。Gα15干扰能减少TSH所诱导的IκB磷酸化，而Gαq或Gα11均不能达到相似的效果。Gα13干扰能显著减少TSH所诱导的ERK1/2和p38磷酸化激活，而Gα12干扰则无相似效果。通过抑制剂阻断PLCβ下游的经典效应分子PKC或Gα12/13下游的效应分子RhoA、Rac和cdc42等，能达到与Gα15或Gα13干扰相似的效果。这提示，在巨噬细胞中，TSH主要通过Gα15/PLCβ/PKCs/IκB/NFκB及Gα13/RhoGTPase/ERK-p38两条通路发挥作用。我们进而观察了Gα13和Gα15siRNA干扰对TSH的效果的影响。qPCR分析显示，与对照siRNA相比，Gα13和Gα15干扰均能部分阻断TSH上调Ccl2、促进单核细胞趋化的作用。这提示Gα13和Gα15均参与到TSH对Ccl2的诱导作用中。 结论: TSH通过结合巨噬细胞的TSHR，能激活Gα15/PLCβ/PKCs/IκB/NFκB及Gα13/RhoGTPase/ERK-p38通路，促进斑块中巨噬细胞的炎症因子和趋化因子的表达，增加单核细胞向斑块募集，增加斑块中巨噬细胞数量，促进动脉粥样硬化。
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