摘要
豆科植物是一种分布广泛的被子植物，约包含751个属，19500个种。豆科物种中的大多数植物属于典型的复叶植物，仅有少数属于单叶植物。复叶相对于单叶大大提高了植物应对恶劣环境的能力，与单叶发育一样，复叶发育也经历三个阶段:叶原基的起始和形成、初级形态建成和次级形态建成。依据复叶植物中小叶的不同排列形式，可以将复叶分为羽状复叶、掌状复叶和单身复叶。豆科植物的形态多样性使之逐渐成为进化发育学、形态发生学和遗传学等学科的重要研究材料。除此之外，豆科植物还是重要的经济作物和食物来源，食物中的蛋白质、维生素等营养元素都与豆科植物密切相关。蒺藜苜蓿是典型的三出羽状复叶，而且是二倍体遗传，并且研究人员已经在蒺藜苜蓿中建立了丰富的突变体库，所以它作为一种典型的豆科模式植物逐渐被广泛的探索研究。 极性建成是叶原基发育成叶片的重要前提。目前，已经有多个参与叶片极性建成的转录因子被挖掘，研究表明，它们之间通过形成一个调控网络来控制叶片极性的正常建成，从而保证叶片正常发育。目前，关于这些极性基因功能的研究大部分集中在单叶植物中，而在复叶植物中只揭示了部分极性基因的功能。KANADI(KAN)是决定叶原基远轴面极性建成的关键因子，但是目前关于KANADI的研究主要集中在玉米、水稻和拟南芥等单叶植物中。KANADI在复叶植物中的功能仍然不清楚，为了解决这个问题，本论文首次在蒺藜苜蓿中展开对KANADI的研究，鉴定并筛选了蒺藜苜蓿MtKANADI(MtKAN)基因的相关突变体并展开深入研究。此外，我们前期的研究数据显示拟南芥中PRE1的蛋白磷酸化对植物生长发育至关重要，而且Ser-67是PRE1发生磷酸化的关键位点。本论文中我们进一步更加完整地证明了蛋白磷酸化对HLH转录因子PRE1功能的重要性，并验证了PRE家族Ser-67位点在蒺藜苜蓿和拟南芥中的功能是保守的。本文的主要研究结果如下: 1.蒺藜苜蓿MtKAN基因家族包含5个成员。利用拟南芥中KAN的基因序列并进行比对分析，发现蒺藜苜蓿基因组中共包括5个MtKAN(MtKAN1、MtKAN2、MtKAN3、MtKAN4和MtKAN5)基因。其中，MtKAN4与AtKAN4的进化关系最近，拟南芥中KAN4主要参与种子胚珠发育，而其余3个基因主要负责叶片等器官的极性发育，此外，本实验室已经有部分数据显示MtKAN4也主要参与种子发育，所以，本研究中我们主要探究MtKAN1、MtKAN2、MtKAN3和MtKAN5基因在蒺藜苜蓿复叶发育中的功能。氨基酸序列分析显示它们均包含GARP结构域(负责与DNA结合)，而且烟草亚细胞定位分析也表明这4个蛋白均定位在细胞核中，以上结果说明MtKAN可以作为核定位因子行使功能。 2.MtKAN基因间功能冗余。为了进一步了解MtKAN1、MtKAN2、MtKAN3和MtKAN5在蒺藜苜蓿复叶发育中的功能。我们首先利用qRT-PCR的方法在野生型植株中分析了它们的组织表达模式，结果表明它们在幼年叶、成年叶、花和果荚等器官中均有不同程度的表达，说明MtKAN基因功能可能具有多效性。我们从蒺藜苜蓿突变体库订购了MtKAN的Tnt1插入突变体，经过鉴定和表型分析，发现mtkan1-1、mtkan2-1、mtkan3-1和mtkan5-1单突变体与野生型相比均没有明显表型，这可能由于MtKAN基因间存在功能冗余导致的。进一步的遗传杂交分析显示，只有MtKAN1和MtKAN3的功能同时缺失时，植株才呈现出与野生型明显不同的表型。而且mtkan1-1mtkan3-1双突变体呈现多种缺陷表型，主要表现为:叶片边缘向上卷曲、茎节处复叶和侧枝数目增多、植株矮小且不育、托叶变细和子叶开裂。此外，互补实验表明MtKAN1和MtKAN3都能恢复mtkan1-1mtkan3-1双突变体的缺陷表型。 3.MtKAN控制蒺藜苜蓿器官的远轴面建成。RNA原位杂交结果显示，MtKAN1和MtKAN3都在叶原基的远轴面表达，此外，MtKAN1在SAM也有少量表达。GUS染色结果也表明MtKAN1和MtKAN3在各个器官中都有表达，而且MtKAN1和MtKAN3的表达模式类似。mtkan1-1mtkan3-1双突变体叶柄和茎维管束中位于近轴面的木质部异位到远轴面，导致维管束被部分近轴化，此外，mtkan1-1mtkan3-1双突变体的叶脉也被部分近轴化。MtKAN1和MtKAN3的功能同时缺失还会导致植株的叶片表皮细胞更加细长，而且mtkan1-1mtkan2-1mtkan3-1、mtkan1-1mtkan3-1mtkan5-1和mtkan1-1mtkan2-1mtkan3-1mtkan5-1突变体的器官极性发育缺陷和叶片形态发育缺陷更加显著。另外，依赖于MtKAN对远轴面极性发育的调控，MtKAN1和MtKAN3过表达植株叶片的形态发育也出现严重缺陷。 4.MtKAN调控复叶模式发育。mtkan1-1mtkan3-1突变体发育早期，在两个侧叶之间的远轴面会额外形成一个小叶(ELL)，而且，通过扫描电镜观察到mtkan1-1mtkan3-1突变体侧叶原基之间的远轴面形成小叶原基(ELLP)。此外，在mtkan1-1mtkan2-1mtkan3-1、mtkan1-1mtkan3-1mtkan5-1和mtkan1-1mtkan2-1mtkan3-1mtkan5-1突变体中均能观察到ELL的形成。统计分析结果表明mtkan1-1mtkan3-1突变体中小叶柄显著缩短，而且石蜡切片分析结果显示mtkan1-1mtkan3-1突变体的小叶柄维管束被部分近轴化，此外，突变体小叶柄中维管束的数目也会部分增多。突变体中的ELL往往呈现喇叭状或者棒状的形态，而且ELL中的维管束也被部分近轴化。 5.mtkan1-1mtkan3-1突变体中ELL的形成部分依赖生长素的最大化分布。我们通过遗传杂交的方法将DR5rev:GFP分别导入野生型和mtkan1-1mtkan3-1突变体中，并利用激光共聚焦显微镜观察GFP信号的分布情况。在mtkan1-1mtkan3-1突变体的ELL原基处观察到较强的GFP信号，说明ELL原基处生长素含量增多。而且，生长素运输抑制剂NPA处理能够部分抑制mtkan1-1mtkan3-1突变体中ELL的形成。以上结果表明突变体中ELLP的起始部分依赖于生长素的最大化分布。 6.MtKAN与MtREV1相互拮抗。本研究中，我们利用qRT-PCR检测到MtREV1在mtkan1-1mtkan3-1突变体中的表达水平显著升高，而且，先前的研究表明MtREV1的异位表达可以导致蒺藜苜蓿复叶模式发生改变，而且这种改变方式与mtkan1-1mtkan3-1突变体中复叶模式的改变方式极为类似。同时，本研究中的转录组分析结果显示MtKAN和MtREV1以拮抗的方式调控与生长素合成和运输相关基因的表达。以上结果说明，MtKAN与MtREV1可能通过拮抗的方式调控相关基因的表达进而参与蒺藜苜蓿复叶模式的建成。 7.mtkan1-1mtkan3-1突变体叶边缘卷曲依赖MtPHAN。本研究中，我们观察到mtkan1-1mtkan3-1突变体叶片边缘向近轴面卷曲，然而，mtphan突变体的叶片边缘向远轴面卷曲(与mtkan1-1mtkan3-1突变体中叶片卷曲方向相反)。MtKAN和MtPHAN分别是控制远轴面极性建成和近轴面极性建成的关键因子，我们检测到MtKAN1和MtKAN3在mtphan突变体中的表达上调，而MtPHAN在mtkan1-1mtkan3-1突变体中的表达也上调，此外，mtphanmtkan1-1mtkan3-1三突变体的叶片呈现扁平的形态。综上所述，我们认为MtKAN与MtPHAN通过相互抑制的方式调控叶片扁平状形态的建成。 8.MtKAN负调控SGL1。SGL1是控制蒺藜苜蓿复叶发育中两个侧叶原基起始的关键因子。qRT-PCR结果显示mtkan1-1mtkan3-1突变体中SGL1的表达水平显著升高，说明SGL1的异位表达可能贡献于mtkan1-1mtkan3-1突变体中ELL的形成。进一步的RNA原位杂交结果显示SGL1在mtkan1-1mtkan3-1突变体ELL处的确有异位表达，同时，sgl1-2mtkan1-1mtkan3-1三突变体植株表现出单叶的表型。以上结果说明mtkan1-1mtkan3-1突变体中ELL的产生依赖SGL1的异位表达。此外，原生质体瞬时表达实验证明MtKAN可以直接或者间接抑制SGL1的转录活性。以上这些实验结果说明SGL1位于MtKAN的下游，而且被MtKAN负调控。 9.PRE1的磷酸化位点与功能分析。我们前期的研究表明Ser-67是PRE1蛋白磷酸化的关键位点，Ser-67突变成Glu-67使PRE1促进细胞伸长的功能被部分抑制，而且细胞伸长相关基因EXP1(EXPANSIN1)和EXP8(EXPANSIN8)的表达也被抑制。此外，Ser-67位点是PRE1与IBH1互作的关键位点。本研究中，我们通过rBiFC和Co-IP的方法进一步验证了Ser-67突变成Glu-67的确降低了PRE1与IBH1的互作。同时，我们分析了Ser-67位点在PRE1同源基因PRE2的保守性，分析结果显示PRE2的Ser-68是与PRE1的Ser-67对应的保守氨基酸位点。为了进一步分析Ser-68对PRE2功能的影响，我们利用酵母双杂交、β-gal分析和BiFC方法证明了Ser-68是PRE2与IBH1互作的关键位点。此外，我们还利用酵母双杂交的方法验证了Ser-67是PRE1与其它HLH蛋白互作的关键位点。酵母三杂和GSTpull-down结果表明Ser-67是PRE1抑制IBH1-HBI1互作的关键位点。通过氨基酸序列比对分析，我们发现蒺藜苜蓿中MtPRE家族也同样存在丝氨酸保守位点，而且遗传分析结果表明Ser-67位点的磷酸化会导致MtPRE1的功能显著降低。
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