摘要
bip130(BR11-interactingprotein130)最早报道是从水稻cDNA文库中筛选到的一种可能与油菜素内酯(BRs)的受体蛋白BRI1的互作蛋白。先前的研究已经显示，bip130参与植物激素脱落酸(ABA)诱导的抗氧化防护，增强作物对干旱、盐胁迫以及氧化胁迫的耐性。然而，ABA信号转导中bip130调控抗氧化防护的分子机制尚有待阐明。为了阐明bip130的作用机制，本实验室前期以bip130为诱饵，利用酵母双杂交技术筛选水稻的cDNA文库，筛选到了一种可能与bip130相互作用的蛋白——质膜H+-ATPaseOSA7。大量的研究已经表明，质膜H+-ATPase在植物的生长发育以及植物对环境胁迫的反应中起着十分重要的作用。在本论文中，我们鉴定了bip130与OSA7是否确实存在相互作用，进而分析了它们之间的互作区域，最后我们调查了它们之间的互作对ABA、干旱以及盐胁迫诱导的质膜H+-ATPase活性的影响。本论文的主要研究结果如下: 通过GSTpull-down分析、酵母双杂交(Yeasttwo-hybrid，Y2H)分析、萤火虫荧光素酶互补成像系统(LCI)分析和双分子荧光互补(BiFC)分析从体内体外证实了bip130与OSA7互作的真实性。利用水稻原生质体瞬时表达分析发现OSA7定位在质膜上，而bip130已被显示定位在质膜、细胞质和细胞核上，这在空间上显示了二者相互作用的可能性。 为了进一步揭示bip130与OSA7的互作区域，利用生物信息学分析了OSA7的蛋白序列和结构，将OSA7截段为4个不同的功能域，分别为跨膜结构域、A域超家族、卤酸脱氢酶(HAD)超家族、细胞质N结构域。利用Y2H和LCI技术证实了bip130与OSA7的胞质N结构域相互作用。同时对比OSA7同源家族蛋白，筛选出与OSA7同源性较高的5个同源蛋白OSA1～5,克隆出其胞质N结构域，Y2H与LCl分析表明这5个同源蛋白的胞质N结构域不与bip130相互作用。 为了探究bip130与OSA7互作是否参与水稻对盐胁迫的响应，我们首先分析了ABA、NaCl处理对水稻OSA7基因表达以及质膜H+-ATPase活性的影响，然后利用qRT-PCR分析ABA处理时bip130与OSA7的上下游关系。利用bip130过表达与干扰(RNAi)突变体分析其对胁迫条件下质膜H+-ATPase活性的影响。最后利用原生质体瞬时表达体系在bip130突变体中瞬时表达和沉默OSA7后检测质膜H+-ATPase的活性。我们的结果显示，ABA和NaCl均可诱导水稻根部中OSA7的基因表达以及质膜H+-ATPase活性上升。在ABA信号通路中bip130位于OSA7的上游;突变体分析结果显示，bip130过表达进一步增强盐胁迫诱导的质膜H+-ATPase活性，而bip130-RNAi阻止盐胁迫诱导的质膜H+-ATPase活性上升。原生质体瞬时表达体系分析结果显示在ABA信号途径中bip130可以调控OSA7活性。这些结果意味着盐胁迫下bip130参与质膜H+-ATPase活性的调控。本论文为进一步研究胁迫条件下bip130的作用机制提供了研究基础。
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