摘要
蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，可以将大分子蛋白质分解成小分子肽，从而实现蛋白质的分解利用。蛋白酶在食品、皮革、丝绸、医药、酿造、化妆品等行业都有着非常广泛的应用。目前使用较多的是来自陆源的蛋白酶，来自海洋微生物的蛋白酶具有原料丰富，制备周期短，制备过程相对较简单等优点，因此具有广阔的开发和应用前景。 本文以耐盐蛋白酶的枝芽孢杆菌（Virgibacillushalodenitrificans）ST-1为研究对象，探究了耐盐蛋白酶菌株的生长特性、耐盐蛋白酶的发酵产酶条件、耐盐蛋白酶的稳定性、耐盐蛋白酶学性质及其酶解特异性。以天然蛋白酶为原料，水解海洋麻虾蛋白获得生物活性肽，以及分离纯化及其活性测定。首先，利用筛选培养基对耐盐菌株进行筛选，从中选出一株高产蛋白酶的菌株，通过单因素试验对菌株的生长条件及其发酵产酶条件进行优化。利用优化得到的最优发酵产酶条件生产耐盐蛋白酶，获得的发酵液经过离心和冻干获得耐盐蛋白酶的冻干粉，并对粗酶液的酶学性质及其酶解特异性进行了初步探索。其次，利用优化后得到的蛋白酶来水解麻虾冻干粉，并对其产物进行活性探究，通过超滤和色谱层析的方法对产物进行分离纯化。最后，将纯化后的物质进行合成并进行了特性研究。研究结果如下： 1．经过单因素实验确定最佳生长培养基为蔗糖0.3%、酵母粉1%、干酪素2%、NaCL7%，初始pH8.0。最优产酶培养基的组成为：葡萄糖0.3%，豌豆粉1%，酪蛋白2%，NaCl7%，初始pH8.0。经过发酵，在30℃培养33h获得最大蛋白酶活力，将蛋白酶活力从优化实验前的20.0U/mL提高到87.0U/mL。 2．利用优化产酶条件后得到的蛋白酶对其粗酶液的酶学性质进行初步探索发现，酶的最适作用温度为50℃，pH6.0时该酶的活性最高，在30℃水浴保温5h酶活力还能保持约90%；40℃保温5h后酶活力还能保持约80%，50℃保温5h后酶失去活力，在pH5.0~8.0范围内有相对好的稳定性，Ba2+、NH4+、Ca2+、Mg2+、K+、Li+、Mn2+、Si2+、Na+对酶有一定的激活作用。 3．利用蛋白酶水解虾蛋白得到水解物的氨基酸的量与酶解时间的关系得到了该天然蛋白酶优先水解Glu-、Asp-、Gly-、Leu-和Lys-肽键。 4．经过蛋白酶ST-1水解麻虾冻干粉得到了水解产物，确定活性物质的分子量为lt;3KDa。然后用SephadexG-25离子交换色谱进行分离，在280nm下进行测量，洗脱组分3在2mg/mL时具有较高的抗氧化活性且对革兰氏阴性致病菌有一定的抑制作用。 5．利用AppliedBiosystems494蛋白测序仪测定洗脱组分3是一个含有13个肽段的多肽混合物，使用LC/MS质谱仪（SHIMADZULCMS-2020）确定了组分3的平均分子量为1922.9Da。 6．将组分3中的各个肽段进行合成，筛选出其中两个肽段WDC和LCK有较高的抗氧化活性和抑菌作用。
NETL