摘要
随着水生生物高密度养殖的普遍发展，水产业面临着各类病害频繁发生的难题，抗生素是防治养殖病害的传统方法，但抗生素会导致生物安全性与环境污染问题。抗菌肽由于其独特的抗菌机理，使细菌不易对其产生耐药性，且因代谢速度快而不会在机体中产生有害残留，被认为是潜在的传统抗生素替代品。由于抗菌肽的人工合成成本较高，又难以直接从生物体内分离获得大批量抗菌肽，采用基因工程技术重组表达抗菌肽是目前较为可行的抗菌肽制备途径。酵母和小球藻具有丰富的蛋白质、脂质、维生素和活性代谢产物，具备多种生物功能，可作为优质的单细胞蛋白源应用于饲料产业。利用基因工程在酵母及小球藻中表达抗菌肽将为抗菌肽在水产生物饵料中的应用提供理论依据和前期基础。 本研究以烟芽夜蛾的抗菌肽Heliomicin的突变基因序列HeM基因为目标基因，以毕赤酵母（Pichiapastoris）和椭圆小球藻（Chlorellaellipsoidea）为转化材料，建立了抗菌肽的两种表达系统。将HeM基因片段与pPIC9K质粒构建重组表达载体，转入毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115中，建立了抗菌肽毕赤酵母表达系统。同时构建了HeM抗菌肽的植物表达载体，建立了磁性纳米颗粒介导的椭圆小球藻的遗传转化体系，并获得了表达抗菌肽的转化藻株。 具体研究内容和结果如下： 1．合成HeM基因序列，构建了毕赤酵母表达载体。将表达载体电转化至毕赤酵母，经过组氨酸缺陷型培养基筛选和PCR验证，获得了成功转化抗菌肽HeM的酵母菌种。经过甲醇诱导表达优化后，利用Tris-Tricine-SDS-PAGE进行目的蛋白检测，证明甲醇能够诱导HeM在毕赤酵母菌株中分泌表达产生HeM抗菌肽，抑菌实验结果表明，基因工程酵母的分泌总蛋白对金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用。 2．通过对小球藻进行纯化培养及抗生素敏感实验确定30mg/L的G418作为椭圆小球藻基因工程的筛选标记。构建了抗菌肽HeM植物表达载体，利用磁性纳米颗粒作为载体，构建磁性纳米颗粒-表达载体复合物，在磁场作用下转化至椭圆小球藻原生质体，建立了磁性纳米颗粒介导的椭圆小球藻转化体系，并将抗菌肽HeM基因转化至椭圆小球藻中，通过G418抗生素筛选、PCR、RT-PCR和Tris-Tricine-SDS-PAGE检测，不同水平检测结果表明抗菌肽HeM基因成功转入椭圆小球藻中并进行了表达，对转基因小球藻蛋白进行抑菌性检测，抑菌实验结果表明，小球藻转化子细胞总蛋白对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。 综上所述，本研究通过抗菌肽HeM在毕赤酵母中成功转化表达，初步探索了抗菌肽表达效果，随后基于纳米技术构建了磁性纳米颗粒介导的椭圆小球藻遗传转化体系，获得了含有抗菌肽的基因工程藻株，实现了抗菌肽HeM在椭圆小球藻中的有效表达，为抗病饵料微藻的开发与应用打下了重要基础。
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