摘要
兜兰因其奇特的花型和持久的花期而具有很高的观赏价值，但近年来由于野生环境的破坏和非法盗采导致其野生种处于濒危状态亟需保护。自然条件下兜兰种子需要与真菌共生才能萌发且共生萌发率极低，目前最为有效的繁育手段是种子非共生萌发。原球茎是兰科植物种子萌发中形成的圆球状繁殖体，可进一步分化出根叶而形成完整的植株。但兜兰原球茎的发育过程中出现了较大比例的发育停滞而导致繁殖效率低下，这一现象严重制约了其保育生物学研究进度和商品化应用。本研究以白旗兜兰原球茎为材料通过转录组测序分析，结合形态结构观察、内源激素含量测定和外源激素处理，期望对白旗兜兰原球茎发育调控机制有更全面的了解，为白旗兜兰的产业化生产和保育提供理论参考和技术支持。本研究主要取得以下结果: 1.对白旗兜兰种子非共生萌发原球茎发育过程连续取材进行显微形态观察，结果发现非共生萌发10d出现正常发育和停滞发育两种生长状态的原球茎，两种生长状态原球茎差异很大。第一种形态的原球茎能够形成组织中心，围绕组织中心有叶原基形成，随后叶原基继续发育成叶，茎尖分生组织(SAM)形成，植株建成，为正常发育原球茎。第二种是发育停滞原球茎:其形态上呈白色近圆形，后期顶端有小凹陷，生长数月后逐渐褐化死亡，结构上没有发育出组织中心，也没能建立顶端分生组织。发现正常发育原球茎发育过程可分为三个阶段:原球茎形成期:种子非共生萌发20d，形态上呈现略透明且顶端带绿色点，极性不明显，结构上能够观察到顶端有排列紧密且细胞核质比较大的细胞构成的生长中心;原球茎极性建成期:种子非共生萌发45d时为芽原基出现，形态上底端较大较圆，顶端有指状突起出现，为早期的SAM，结构上细胞极性分布更加明显，底端细胞体积有增大且薄壁化，顶端组织中心进一步扩展，邻近组织中心有叶原基出现;原球茎形态建成期:种子非共生萌发60d为有芽阶段，形态上顶端突起变大且绿色加深，底部也稍有膨大，结构上顶端细胞分裂旺盛，细胞数目增多，叶原基继续向外扩展，底端细胞进一步空泡化，体积增大有限。 2.对非共生萌发45d两种状态原球茎进行取材和激素含量测定，发现正常发育原球茎中CK/IAA比值较高，而停滞发育原球茎中CK/IAA比值低，IAA含量比正常发育原球茎中高出约六十倍，我们推测内源高浓度生长素的积累促进原球茎细胞分裂但是抑制原球茎细胞的极性建成和器官分化是导致原球茎发育停滞的主要原因。在萌发过程中GA和ABA有拮抗作用，停滞发育原球茎中ABA含量比正常发育原球茎高出4倍左右，GA只检测出少量GA3.而正常发育原球茎以GA4为主，含量也较高说明GA4在原球茎发育中可能有重要作用。在正常发育原球茎中GA/ABA比值比停滞发育原球茎要高，推测这两种激素对原球茎发育有重要作用。 3.为验证植物激素在白旗兜兰非共生萌发和原球茎发育中的作用，分别对白旗兜兰非共生萌发的种子和原球茎进行外源生长素和生长素抑制剂处理。实验结果显示添加2mg/LZT的VW培养基上种子萌发率比对照组明显要高，分别为63.33％和41.67％。将正常发育原球茎转移到添加了生长素转运抑制剂TIBA的H26培养基上培养:在50mg/LTIBA的H26培养基上原球茎一周内就全部褐化死亡，验证了过量生长素积累对原球茎发育的毒害作用。在添加了20mg/LNAA的H26培养基上发育正常原球茎能够继续生长，但植株会变的矮小且在生长60d时就有根形成，相比生根大概需要90d的对照组提早30d。发育停滞原球茎在添加了20mg/LNAA的H26培养基上会形成愈伤组织，外源生长素NAA促进正常发育原球茎形态建成，而对于发育停滞状态原球茎促使其脱分化形成愈伤组织。 4.为了从分子水平上研究兜兰原球茎发育的机制，对三个关键时期正常发育和发育停滞原球茎取材进行转录组测序得到这一过程的基因表达谱。对差异基因进行统计发现原球茎初期差异数目最多。差异基因的KEGG富集分析表明植物植物激素和信号转导苯丙类物质合成途径的许多基因参与调控原球茎发育过程。在停滞发育原球茎中生长素合成和转运相关基因表达量高，生长素分解基因表达量低，这可能与高浓度生长素积累有关。 本研究明确了兜兰原球茎发育过程中的形态学和细胞结构特征，同时发现生长素对原球茎发育起到重要调控作用，对兜兰原球茎发育过程有了更进一步的了解，为兜兰的产业化生产和保育工作提供了理论依据。
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