摘要
随着免疫抑制剂、抗生素的广泛使用，白色念珠菌感染者日渐增多，并且耐药菌株大量出现，给临床治疗带来困难。因此，开发新型药物迫在眉睫。本研究探讨了生防海洋解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）GM-1-1菌株对白色念珠菌的抑制作用，优化了GM-1-1菌株产抗菌物质的摇瓶发酵培养基和发酵条件；揭示GM-1-1菌株对白色念珠菌的抗菌作用机理，并初步研究了其抗氧化活性；分离纯化GM-1-1菌株代谢产物中的抗菌活性组分，建立海洋细菌抗真菌活性物质分离纯化关键技术，为该菌株的进一步开发和应用提供物质基础和理论依据。主要研究方法和结果如下： （1）GM-1-1菌株产抑菌物质摇瓶发酵培养基和发酵条件优化 为了提高GM-1-1菌株发酵液中的细菌总数和对白色念珠菌的抑菌效果，以OD600值和发酵液的抑菌圈直径作为检测指标，采用单因素试验和正交试验优化摇瓶发酵培养基和其发酵条件。研究结果表明GM-1-1菌株生长及产生抑菌物质的最适培养基配方为：玉米糊精20g/L，牛肉膏15g/L，无水硫酸镁1.4g/L。最佳发酵条件为：温度为28℃，发酵初始pH为7.0，摇床转速为220r/min，摇床培养时间28h，种子液浓度为108个细胞/mL，接种量为10%，装液量为50mL/250mL。在经过优化的发酵培养基和摇瓶发酵条件下，GM-1-1菌株发酵液的抑菌活性和菌体生长量均有了明显的提高，最大的抑菌圈直径达到了38mm，OD600值为1.672。 （2）GM-1-1菌株抗菌作用机理研究 为了探究生防解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）GM-1-1菌株无菌发酵液对白色念珠菌(Candidaalbicans)的抑制作用及其抗菌作用机理，采用牛津杯法初步探究菌株对白色念珠菌的抗菌性质，采用微量稀释法确定GM-1-1菌株的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。通过扫描电镜法、MTT法、分光光度法等测定发酵液对白色念珠菌孢子萌发、细胞形态、生物被膜的形成、细胞及细胞膜通透性的影响，初步探讨其抗菌作用机理。研究结果表明，GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌具有明显的抑制作用，抑菌圈直径达39.5mm；受抑制的白色念珠菌在不加发酵液的培养基上仍能继续生长，初步认为GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌的繁殖具有抑制作用，处理后的白色念珠菌不能形成新的细胞，但不能杀死已经形成的细胞；无菌发酵液的MIC值为40mg/mL，MBC值为80mg/mL；无菌发酵液对白色念珠菌的孢子萌发具有强烈的抑制作用；扫描电镜下发现处理后的白色念珠菌细胞表面出现凹陷和孔洞，形态不规则，细胞壁残缺；无菌发酵液抑制白色念珠菌生物被膜的形成，破坏了细胞和细胞膜的通透性。 （3）GM-1-1菌株抗菌小分子化合物分离纯化 为了研究GM-1-1菌株产生的抗菌活性物质，以对白色念珠菌的生物活性为追踪，采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析、薄层层析以及高效液相色谱法等方法分离纯化源自海洋的解淀粉芽孢杆菌GM-1-1菌株的抗菌活性组分，通过GC-MS法对抗菌活性组分进行结构鉴定。最终从GM-1-1菌株发酵液的甲苯萃取相中分离纯化出1个抗菌活性组分，推测活性组分为酰胺类物质，其结构式为C22H43NO。 （4）GM-1-1菌株抗菌蛋白的分离纯化 以白色念珠菌为指示菌进行活性追踪，采用硫酸铵分级沉淀法对GM-1-1发酵液中的抗菌蛋白进行初步分离提纯。试验结果表明，经硫酸铵沉淀后得到粗蛋白液对白色念珠菌几乎无抑制作用，而上清液对白色念珠菌则具有强烈的抑菌效果，推测GM-1-1菌株发酵液中抑制白色念珠菌的活性组分不是大分子的一些活性蛋白类物质。但粗蛋白液对小麦根腐病菌（Bipolarissorokiniana）等6种病原真菌均具有一定的抑制作用。 （5）GM-1-1菌株抗氧化活性研究 通过水杨酸法和邻苯三酚自氧化法等测定了海洋细菌GM-1-1菌株无菌发酵液对超氧阴离子，羟基自由基，DPPH自由基的清除效果以及测定了无菌发酵液的总还原能力。初步探究GM-1-1菌株抗氧化能力。试验结果表明：当无菌发酵液的浓度为160mg/mL，其对DPPH自由基清除率为45.31%，羟基自由基清除率为46.43%，超氧阴离子自由基清除率为46.20%；总还原力测定试验结果表明在700nm波长处的吸光值为2.863。
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