摘要
类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis，RA)是一种慢性自身免疫疾病，引起患者关节软骨损伤、运动能力丧失，全球发病率约为0.5％。RA尚无特异性的诊断方法，治疗以控制疾病进展为主。遗传、生活习惯、环境等构成RA主要风险因素，但是其具体发病原因尚不清楚。在RA中自身反应性T细胞通过表面T细胞受体(T-cellreceptor，TCR)识别自身抗原，参与疾病进展、导致机体免疫耐受破坏，因此RA相关TCR是潜在生物标志物。本研究通过分析206例RA患者外周血TCRβ链(TCRβ)信息，以及鉴定异常CD4+细胞分化，寻找RA相关的TCRβ库特征;为进一步鉴定RA相关TCR克隆特异性，本课题开发基于液滴微流控的高通量TCR抗原特异性验证方法。研究主要结果如下: (1)RA患者外周血TCRβ库有24个TRBV基因频率增加、14个降低。基于差异TRBV基因可以建立准确的RA分类器(AUC=0.97，95％CI=0.96-0.98)，表明V基因使用差异是RA生物标志物。 (2)本研究鉴定出53个RA中差异表达的克隆是RA相关克隆。这些克隆可用于建立准确RA分类器，证明RA相关克隆是生物标志物。RA相关克隆富集程度和DAS28(p=0.027)、ESR(p=0.008)、ANA(p=0.027)、IgG(p=0.012)等临床指标相关，表明RA相关克隆扩增和疾病进展关联，具有临床价值。 (3)在RA患者外周血CD4+T细胞亚群分析层面上，RA患者外周血CD4+效应记忆T细胞(Tem)和辅助17型T细胞(Th17)的TCRβ库多样性降低，表明患者CD4+Tem和Th17发生克隆性扩增。幼稚T细胞(Tn)、Tem、Th17偏好使用的TRBV3-1基因在RA患者关节滑膜中高表达(p＜0.05)，以及Tem、Th17的TCRβ库相似性增加，暗示RA患者Tem和Th17存在异常的细胞分化关联。体外Th17诱导实验中，RA患者Tem的Th17的分化比例较健康对照显著增加，证明RA患者外周血Tem的Th17分化能力增强。同时，Tem和Th17相似克隆富集和疾病活动指数相关，表明这些克隆与RA病理进展相关。 (4)由于RA相关克隆数量以及潜在自身抗原种类较多，现有方法难以实现RA相关克隆的抗原特异性验证。本研究改进现有液滴微流控和细胞报告系统相结合的方法，实现了筛选效率的提升（每秒筛选450个液滴、筛选准确率70％、细胞富集效率4.43倍）;借助液滴注射和抗原分子标签方法，实现单细胞水平的TCR-抗原特异性识别关系鉴定。这一方法的改进将为后续研究RA相关克隆的抗原特异性功能提供技术支撑。 综上所述，本研究系统探究了RA患者外周血TCRβ库特征，揭示TCRβ库中TRBV基因以及53个RA相关克隆是RA生物标志物，为建立基于TCR库特征的诊断工具提供了依据和方法;本研究发现RA患者Tem的Th17分化能力增加，为T细胞病理机制研究提供线索;验证了基于液滴微流控的高通量TCR抗原特异性验证方法的可行性，为进一步开发高效的验证方法，以实现RA自身反应性克隆的鉴定，乃至RA特异性诊断方法的建立提供了技术准备。
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