摘要
寨卡病毒(ZikaVirus，ZIKV)是黄病毒科黄病毒属的一种单股正链RNA病毒，主要靠伊蚊传播，寨卡感染会导致格林-巴利综合征病例，新生儿小头症以及男性不育，是在全球范围内具有广泛危害的一类病毒。虽然目前已经有不少疫苗正在不同的研发阶段，但目前仍然没有获批的疫苗或者特效药物，因此开发出安全高效的疫苗或者特效药物具有重要的意义。 寨卡病毒囊膜蛋白E蛋白是疫苗设计与药物筛选的重要靶标。目前鉴定出的E蛋白上的抗原表位主要有3种，一种是融合环表位（fusionloopepitope，FLE），广谱但抗体中和活性较差，而且有研究称针对该表位的抗体往往还伴随着抗体依赖的感染增强(antibody-dependentenhancement，ADE)效应;第二种是针对结构域Ⅲ的ZEDⅢ表位，中和活性比较好但不广谱;第三种抗原表位是依赖于E蛋白二聚体的表位(E-dimerepitope，EDE)，相对于前两种抗原表位而言，针对EDE的抗体不仅有着高效的中和能力还有较好的广谱能力，同时诱导的ADE效应更低。要诱导出针对EDE的抗体，需要制备模拟天然构象的E-dimer。但是体外表达的野生E蛋白只能以单体的形式存在，需要对其进行改造。因此，在体外表达出接近于天然粒子构象的反向平行二聚体的E蛋白成为工作的重点和难点。 实验室前期设计并制备了由CH3结构域通过非共价相互作用介导了E蛋白的二聚化的二聚体抗原ZE-Fc，通过靶向EDE的阳性抗体证实了该二聚体不仅展示了线性表位还成功展示了高级结构表位，并且通过小鼠免疫发现ZE-Fc诱导的抗体的中和效果比单体诱导的抗体中和效果更好，然后提取免疫小鼠的脾细胞的RNA构建了噬菌体展示抗体库，但没有筛选到靶向EDE的候选抗体克隆。本研究在此工作的基础上，首先通过改变筛选方法，进行了抗体筛选的尝试。 我们将E单体与磁珠进行偶联，与噬菌体展示库进行孵育后，去掉与E单体结合的噬菌体，然后在利用ZE-Fc为抗原进行筛选，希望最大程度的减少针对单体的抗体的比例，从而增加筛选到针对EDE抗体的可能性。经过3轮的抗体筛选，序列分析，我们选择了4株CDR区不同的候选克隆，经过后续的评价发现其中3株候选克隆具有nM水平的寨卡中和活性。但遗憾的一点是，在进一步的鉴定中发现候选克隆与E-dimer的结合和与E单体的结合无明显差别，可能不是我们现在预期获得的针对EDE的抗体，但其中的一株候选克隆N12A跟二聚体ZE-Fc的结合强于跟E单体的结合，其结合表位是否跨结构域可能需要具体的结构解析才能够知道。 我们推测筛选针对EDE抗体结果未达到预期的可能原因之一是ZE-Fc中的E-dimer的构象没有免疫优势，或者在体内的构象仍跟天然EDE有差异，导致其免疫产生的EDE抗体含量偏低导致筛选困难。因此，可能需要对ZE-Fc进行进一步优化。 为了更大程度模拟天然病毒粒子表明的E-dimer构象，我们对Fc与E蛋白之间的linker长度进行了调整，设计了6种长度的linker。经过后续的表达与鉴定，最终选择了两种性质稳定、表达量高，并且与ZE-Fc相比更易被阳性抗体识别的候选克隆ZE-L2-Fc和ZE-L3-Fc。用ZE-Fc、ZE-L2-Fc和ZE-L3-Fc免疫小鼠后，经鉴定发现ZE-L2-Fc可以诱导比ZE-Fc更高的抗体滴度。在中和能力方面，来源于ZE-L2-Fc、ZE-L3-Fc的免疫血清中和ZIKV的能力比ZE-Fc更强，但对于登革病毒(DENV)的中和能力则是来源于ZE-Fc的免疫血清效果更好。上述实验证明，linker的长度能够对ZE-Fc诱导产生抗体的偏向性造成影响，为后续的疫苗设计提供了重要参考。 总的来说，本研究在前期工作的基础上，对筛库方法进行了改进，筛选到了3株具有中和ZIKV活性的候选克隆，其中1株可能在识别E-dimer和E蛋白上有差异，但是需要进一步进行鉴定。另外，我们对ZE-Fc之间的linker进行了优化，发现linker的长短能够调节免疫反应的方向。这些工作的开展，为进一步制备能够诱导出针对EDE抗体的免疫原奠定了基础，为靶向EDE的药物和疫苗研发提供了更多依据。
NETL