摘要
流感病毒是在全球范围内流行和传播的重要呼吸道病原体之一，每年导致约300-500万严重流感感染病例，29-65万死亡病例。流感不仅给全球造成了巨大的经济负担，也对全球公共卫生健康构成了严重威胁。而在不同亚型的流感病毒中，A型流感病毒(IAV)对人类威胁最大。人类感染IAV会出现轻症、重症，甚至死亡。IAV感染宿主后的致病机制亟待被阐明。 根据感染IAV后尸检结果显示，在肺部可观察到严重的细胞死亡和炎症反应。上、下呼吸道和肺实质的细胞过度死亡会进一步加剧炎症，破坏上皮细胞屏障的完整性，并最终导致呼吸衰竭甚至宿主死亡。细胞死亡和炎症反应的强烈程度也可以作为区分轻度和重度感染的标志。因此，从细胞死亡角度有望全新解析IAV致病机制。 (DNA-dependentactivatorofIFN-regulatoryfactors)DAI是一种胞质DNA传感器，在炎症激活、细胞死亡和宿主防御中发挥重要作用。DAI通过识别IAV基因组，之后招募一系列关键接头蛋白，如RIPK1、RIPK3、NLRP3、caspase-6和caspase-8等，形成大型信号复合物PANoptosome，随后诱导细胞发生凋亡、坏死性凋亡和焦亡。PANoptosome的组装对IAV触发细胞死亡和炎症反应至关重要。然而，其组装调控的分子机制还不完全清楚。因此，对PANoptosome组装调控机制的探究，将为人们进一步了解IAV感染的致病机制提供重要的数据支持。 本文首先利用邻近标记技术筛选到宿主蛋白SPAG9，并发现SPAG9通过与DAI相互作用而被招募到PANoptosome，当敲除SPAG9后，发现IAV诱导的细胞死亡被明显抑制。进一步实验发现，敲除SPAG9可同时抑制IAV诱导的细胞凋亡、坏死性凋亡和焦亡。接着使用全局性凋亡诱导方式:紫外照射和药物依托泊苷，发现敲除SPAG9不能抑制全局性诱导方式所触发的细胞凋亡。通过使用全局性坏死性凋亡诱导剂TNFα和zVAD以及LPS和zVAD诱导细胞坏死性凋亡，发现敲除SPAG9不能抑制两组全局性坏死性凋亡诱导剂触发的细胞坏死性凋亡。以上结果表明，SPAG9可以独立于紫外照射和依托泊苷诱导细胞凋亡途径和TNFα+zVAD以及LPS+zVAD诱导的坏死性凋亡途径而促进IAV诱导的细胞凋亡和坏死性凋亡。接下来我们对SPAG9下游信号通路进行了探究。SPAG9主要通过MAPK通路发挥作用，所以我们在感染的细胞中添加MAPK通路中三个主要激酶JNK、p38、ERK的抑制剂，发现只有当加入JNK抑制剂后，可以减少IAV诱导的细胞死亡。进一步研究发现，当敲低JNK1/2后可以同时抑制IAV诱导的细胞凋亡、坏死性凋亡和焦亡。我们使用紫外照射和药物依托泊苷处理后发现，JNK抑制剂不能抑制全局性诱导方式导致的细胞凋亡。然后我们使用坏死性凋亡诱导剂TNFα和zVAD以及LPS和zVAD诱导细胞。结果显示，JNK抑制剂不能抑制两组全局性坏死性凋亡诱导剂触发的细胞坏死性凋亡。以上结果说明，JNK可以独立于紫外照射和依托泊苷诱导细胞凋亡途径和TNFα+zVAD以及LPS+zVAD诱导的坏死性凋亡途径而促进IAV诱导的细胞凋亡和坏死性凋亡。接下来我们探究JNK的激活是否依赖于DAI/SPAG9轴。我们的研究结果显示，无论是在外源性过表达条件下还是内源性感染IAV条件下，JNK可以依赖于DAI/SPAG9轴而被激活。同时，我们发现DAI的N端Zα结构域对JNK激活是必须的，而C端死亡结构域DeathDomin(DD)对JNK激活是非必须的。最后我们对DAI/SPAG9/JNK轴是如何促进IAV诱导细胞死亡进行了探究。发现该轴可以通过促进PANoptosome组装（RIPK1、RIPK3、DAI的相互作用增强），而促进IAV诱导的细胞死亡。 综上，我们的发现揭示了SPAG9的新功能，作为一种重要的免疫调节因子，参与DAI介导的JNK信号通路的激活和细胞死亡。在分子水平上，我们发现SPAG9通过促进DAI依赖的JNK信号通路激活促进PANoptosome组装，形成正反馈回路，进一步增强RIPK1、RIPK3和DAI之间的相互作用。这些结果拓宽了我们对DAI/SPAG9/JNK信号通路调控PANoptosome组装机制的理解。
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