摘要
第一部分TJ-M2010-5对CCl4诱导的小鼠肝纤维化的作用及机制研究 【目的】探讨自主研发的MyD88抑制剂TJ-M2010-5对CCl4诱导的小鼠肝纤维化的作用及可能的机制。 【方法】通过为C57BL/6雄性小鼠腹腔注射CCl4建立肝纤维化模型，并通过腹腔注射TJ-M2010-5进行干预。实验分为4组：正常对照组（Control组）：按照3mL/kg的剂量，每周3次为小鼠腹腔注射玉米油；CCl4组：按照3mL/kg的剂量，每周3次为小鼠腹腔注射20%的CCl4玉米油溶液；TJ-M2010-5干预组（CCl4+TJ-M2010-5组）：按照3mL/kg的剂量，每周3次为小鼠腹腔注射20%的CCl4玉米油溶液，同时，按照60mg/kg的剂量，每日1次为小鼠腹腔注射TJ-M2010-5溶液；TJ-M2010-5对照组：按照3mL/kg的剂量，每周3次为小鼠腹腔注射玉米油，同时每日1次为小鼠进行腹腔注射TJ-M2010-5（60mg/kg）溶液。实验6周后，收集小鼠的血清和肝脏组织标本。通过Masson染色及Ishak肝纤维化评分评估肝组织纤维化情况；通过免疫组化、Westernblot、qRT-PCR和免疫荧光技术检测肝组织内COL1A1、α-SMA、TGF-β1、p-Smad2/3、MyD88及NF-κB的表达；通过检测血清AST和ALT的水平来评估肝功能；通过Tunel染色评估肝组织细胞凋亡情况；通过HE染色和血清TNF-α和IL-1β的水平来反映炎症情况。 【结果】Masson染色显示，CCl4组小鼠肝脏组织出现明显的胶原沉积，肝纤维化评分显著升高；而TJ-M2010-5的干预显著减轻了CCl4诱导的胶原沉积，同时降低了肝纤维化评分。免疫组化、Westernblot和qRT-PCR检测结果显示，TJ-M2010-5的干预显著抑制了CCl4诱导的小鼠肝组织COL1A1、α-SMA的表达和TGF-β1/p-Smad2/3通路的激活。HE染色、Tunel染色、血清AST、ALT检测和血清炎症因子检测表明，CCl4组小鼠肝脏组织出现明显的炎症反应，细胞凋亡明显增加，血清AST和ALT水平以及炎症因子TNF-α和IL-1β的水平明显升高；而TJ-M2010-5的干预显著抑制了CCl4诱导的炎症反应和肝损伤。此外，CCl4组小鼠肝脏组织MyD88表达明显上调，NF-κB的核转移明显增加；而TJ-M2010-5的干预显著抑制了CCl4诱导的小鼠肝脏组织中MyD88/NF-κB通路的激活。 【结论】1、TJ-M2010-5可以显著抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化；2、TJ-M2010-5可以显著抑制CCl4诱导的小鼠肝损伤和炎症反应；3、通过抑制MyD88/NF-κB通路的激活进而减轻肝损伤和炎症反应，是TJ-M2010-5对肝纤维化发挥抑制作用的主要机制。 第二部分TJ-M2010-5对LX2细胞的作用及机制研究 【目的】LX2细胞是人类来源的肝星状细胞系，与人类肝星状细胞有相似的特征。本研究旨在探讨TJ-M2010-5对LX2细胞是否具有直接抗肝纤维化的作用及其可能的机制，从而为TJ-M2010-5的临床转化提供依据。 【方法】将LX2细胞种于96孔板，实验分组为：Control组、TGF-β1组和TGF-β1+TJ-M2010-5组，其中TGF-β1+TJ-M2010-5组设置TJ-M2010-5浓度梯度为10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L。培养24h后按照分组加入TGF-β1（10ng/mL）和不同浓度的TJ-M2010-5。干预结束后，通过CCK8法检测TJ-M2010-5对LX2细胞增殖的影响。将LX2细胞种于6孔板，分组和干预措施同上，通过流式细胞术检测细胞的凋亡情况，并使用生化仪检测上清液LDH的释放量，进而评估TJ-M2010-5对LX2细胞的毒性。根据上述结果，后续实验选择30μmol/L作为TJ-M2010-5的给药浓度。再将实验分组为：Control组、TGF-β1组、TJ-M2010-5干预组（TGF-β1+TJ-M2010-5（30μmol/L））和TJ-M2010-5对照组（TJ-M2010-5（30μmol/L））。将LX2细胞种于10cm培养皿，干预结束后，收集细胞和细胞上清液，通过Westernblot和qRT-PCR技术检测TJ-M2010-5对LX2细胞α-SMA、COL1A1、p-Smad2/3、BAMBI、MyD88、MMP-1表达水平的影响，并通过ELISA检测细胞上清液MMP-1的水平。将LX2细胞种于15mm规格的玻底培养皿和10cm普通培养皿，干预结束后，通过免疫荧光和Westernblot技术检测TJ-M2010-5对LX2细胞NF-κB核转移的影响。 【结果】TJ-M2010-5以浓度依赖的方式抑制LX2的增殖，浓度越高对LX2细胞增殖的抑制作用越强；当TJ-M2010-5的浓度超过30μmol/L会出现明显的细胞毒性，因此后续实验选择30μmol/L作为TJ-M2010-5用药浓度。结果显示，与Control组相比，TGF-β1的刺激诱导了α-SMA在LX2细胞中的进一步表达，而TJ-M2010-5的干预显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA的表达。此外，TJ-M2010-5对照组与Control组相比，LX2细胞α-SMA的表达也明显受到抑制，这表明TJ-M2010-5可以显著抑制LX2细胞的活化。Westernblot和qRT-PCR结果表明，TGF-β1的刺激显著上调了LX2细胞COL1A1和p-Smad2/3的表达水平，并抑制了BAMBI的表达。而TJ-M2010-5的处理显著上调了BAMBI的表达水平，并抑制了LX2细胞COL1A1和p-Smad2/3的表达。由于BAMBI的主要作用是沉默TGF-β1信号，所以TJ-M2010-5通过上调BAMBI进而降低了LX2细胞对TGF-β1的敏感性。Westernblot和免疫荧光的结果显示，TJ-M2010-5的干预显著抑制了TGF-β1诱导的LX2细胞MyD88/NF-κB通路激活，降低了MyD88的表达和NF-κB的核转移。由于在肝星状细胞中，BAMBI的表达是受MyD88/NF-κB通路调控的，因此，上述结果表明，TJ-M2010-5通过抑制MyD88/NF-κB通路来上调BAMBI的表达，进而降低LX2细胞对TGF-β1的敏感性。此外，ELISA与qRT-PCR结果表明，MMP-1的表达在TGF-β1组受到抑制，而TJ-M2010-5的处理显著上调了MMP-1在LX2细胞中的表达，这说明TJ-M2010-5可能具有促进纤维胶原降解的潜在作用。 【结论】1、TJ-M2010-5可以显著抑制LX2细胞的增殖和活化；2、TJ-M2010-5可以通过抑制MyD88/NF-κB通路来上调BAMBI的表达，进而降低LX2细胞对TGF-β1的敏感性；3、TJ-M2010-5可以显著上调MMP-1在LX2细胞中的表达。
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