摘要
本试验建立氟暴露HepG2细胞模型，分析不同剂量的氟离子（Fluorineion，F?）对HepG2细胞的活性、生长形态、超微结构、细胞周期及细胞内氧化应激的影响，从凋亡和铁死亡两个角度研究F?诱导细胞死亡的方式，为阐明氟致HepG2细胞损伤的分子机制提供理论依据，结果如下： 1.氟对细胞生长和增殖影响的研究 1.1氟对HepG2细胞活力和增殖的影响 CCK-8法检测表明，HepG2细胞的存活率随F?暴露剂量（1、2.5、5、10、20和50mmol/L）增加而逐渐降低，F?对HepG2细胞48h的IC50为3.76mmol/L。根据F?对HepG2细胞的IC50测定结果，选择0、1.25、1.88、2.51、3.76、5.01、6.27和7.52mmol/LF?暴露浓度分别处理HepG2细胞0、24、48、72和96h，通过CCK-8法检测，结果表明HepG2细胞的活力发生不同程度的降低，且随时间增加细胞活力降低更加显著，呈现剂量-时间依赖效应。 1.2氟对HepG2细胞形态和超微结构的影响 观察细胞形态，0mmol/LF?组细胞大小正常，生长良好，细胞边缘清晰，聚集成片生长，1.88、2.51和3.76mmol/LF?组细胞随浓度增加，细胞生长状态差，形状有向两边拉长的趋势，细胞密度降低，数目减少，边缘模糊；观察细胞超微结构，0mmol/LF?组细胞表面微绒毛完整，可见清晰的双层核膜，内质网、线粒体形态结构正常，3.76mmol/LF?组细胞微绒毛断裂甚至消失，细胞内大量溶酶体和脂肪滴，线粒体缩小、嵴断裂，内质网扩张。 1.3氟对HepG2细胞DNA的影响 免疫荧光检测发现，与0mmol/LF?组相比，1.88、2.51和3.76mmol/LF?组PCNA蛋白表达表达降低（P＜0.01），F?抑制了HepG2细胞DNA的合成；与0mmol/LF?组相比，2.51和3.76mmol/LF?组HepG2细胞的γ-H2AX表达上升了（P＜0.01），表明F?引起了HepG2细胞DNA双链的断裂。 1.4氟对HepG2细胞周期的调控 流式细胞术分析表明，与0mmol/LF?组相比，1.88、2.51和3.76mmol/LF?组HepG2细胞G0/G1期细胞比例分别降低（P＜0.01）；同时S期细胞的比例增加了（P＜0.05或P＜0.01），G2/M期细胞比例无明显变化，细胞在S期阻滞。 1.5氟对HepG2细胞周期蛋白的影响 采用免疫荧光分析、WesternBlot和实时荧光定量PCR法检测细胞内ATM、CHK2、CDC25A、CDK2和CyclinA2/D1/E1的蛋白和mRNA表达，结果发现，与0mmol/LF?组相比，在F?组中，cyclinD1的mRNA和蛋白水平升高（P＜0.01），而ATM、CHK2、CDC25A、cyclinA2、cyclinE1和CDK2的mRNA和蛋白水平降低（P＜0.05或P＜0.01）。 1.6氟对HepG2细胞的氧化损伤 通过流式细胞术检测分析，与0mmol/LF?组相比，1.88、2.51和3.76mmol/LF?组中，细胞内ROS水平上升（P＜0.05或P＜0.01）；酶标仪检测结果显示，与0mmol/LF?组相比，在1.88，2.51和3.76mmol/LF?组，T-SOD活性降低（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量相应增加（P＜0.05或P＜0.01）；通过JC-1荧光探针检测发现，与0mmol/LF?组相比，随着F?剂量的增加，MMP逐渐降低，绿色荧光/红色荧光强度增加（P＜0.01）。 1.7氟对HepG2细胞凋亡的影响 通过流式细胞术检测细胞凋亡，与对照组相比，1.88、2.51和3.76mmol/LF?组未见明显的凋亡阳性细胞增加（P＞0.05）。 2.氟对HepG2细胞铁死亡的影响 2.1氟对HepG2细胞形态观察和活力的影响 观察细胞形态，0mmol/LF?组HepG2细胞生长良好，细胞边缘清晰；与0mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?组细胞密度降低，细胞大小不一，形态不规则，有向两端拉长趋势，细胞边缘模糊不清；与2.51mmol/LF?组相比，10μmol/LFer-1+2.51mmol/LF?组细胞密度降低，细胞两端拉长趋势较2.51mmol/LF?组弱，部分细胞边缘模糊，整体状态好于2.51mmol/LF?组。 2.2氟对HepG2细胞活力的影响 CCK-8测定结果表明，与0mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?组细胞活力降低（P＜0.01），与2.51mmol/LF?组相比，10μmol/LFer-1+2.51mmol/LF?组细胞活力升高（P＜0.01），试验证实加入Fer-1能够提升细胞活力。试验过程中，溶剂DMSO对细胞活力无明显影响。 2.3氟对细胞氧化应激的影响 检测细胞氧化标志物发现，与0mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?组T-SOD和GSH-PX活性分别降低（P＜0.01），GSH和GPX4含量分别降低（P＜0.01），同时MDA和LDH含量分别升高（P＜0.01）；与2.51mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?+10μmol/LFer-1组的T-SOD和GSH-PX活性分别提高了（P＜0.01），GSH和GPX4含量分别提高（P＞0.05），MDA和LDH含量分别降低（P＜0.01）。荧光检测结果发现，与0mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?组ROS上升（P＜0.01），MMP下降，绿色荧光/比红色荧光强度增加（P＜0.01）；与2.51mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?+10μmol/LFer-1组的ROS水平降低（P＜0.01），MMP升高，绿色荧光/比红色荧光降低（P＜0.01）。 2.4氟对HepG2细胞内铁含量的影响 检测细胞内铁含量结果表明，与0mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?组细胞铁含量提高（P＜0.01），与2.51mmol/LF?组相比，10μmol/LFer-1+2.51mmol/LF?组的铁含量降低（P＜0.01）。 2.5氟对HepG2细胞内铁死亡相关基因表达的影响 与0mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?组SLC40A1的mRNA表达下降（P＜0.05），10μmol/LFer-1组的mRNA表达上升（P＜0.05）；与0mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?组TFRC的mRNA表达上升（P＜0.01），2.51mmol/LF?+10μmol/LFer-1组的mRNA表达上升（P＜0.01）。与0mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?组CD98的mRNA表达下降（P＜0.01），10μmol/LFer-1组的mRNA表达上升（P＜0.05）；xCT的mRNA各组表达无明显变化（P＞0.05）。 与0mmol/LF?组相比，10μmol/LFer-1组的SLC40A1蛋白表达上升（P＜0.01）；与0mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?组TFRC的蛋白表达上升（P＜0.01），2.51mmol/LF?+10μmol/LFer-1组的蛋白表达上升（P＜0.01）；与0mmol/LF?组相比，2.51mmol/LF?组CD98的蛋白表达下降（P＜0.01），10μmol/LFer-1组的蛋白表达下降（P＜0.01），2.51mmol/LF?+10μmol/LFer-1组的蛋白表达下降（P＜0.01）；xCT的蛋白各组表达表达无明显变化（P＞0.05）。 综上所述，过量的F?通过干扰ATM/CHK2信号通路、抑制线粒体功能、诱导DSBs，造成细胞周期的停滞，影响了HepG2细胞的增殖活性，通过抑制GSH水平进而影响GSH-PX、GPX4活性和ROS水平引起细胞的氧化应激，打破铁代谢平衡，造成了HepG2细胞的铁死亡。
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