摘要
用于皮内/皮下软组织修复重建的水凝胶具有广泛的临床需求。透明质酸钠(SH)水凝胶具有亲水、保水、塑形能力强的优点，但体内降解速度极快，细胞亲和性较弱，引导缺损软组织的再生修复的能力有限。丝素蛋白(SF)作为一种纤维状蛋白，生物降解速度较慢，对细胞的黏附和引导迁移能力较强，但是再生SF水凝胶的保水及抗压性能仍有待提高。 通过共混能够改善SH或SF凝胶各自的不足。而SH/SF共混水凝胶的性能直接取决于共混方式、交联方式和凝胶内部的网络结构。寻找SH和SF两种天然高分子的共混和交联新方式，构建更能充分发挥SH和SF各自性能优势的SH/SF共混水凝胶，提高其力学性能，降低其生物降解速率，是SH/SF共混水凝胶用于软组织修复领域需要解决的关键问题。 本研究提出一种基于共价交联的具备双网络结构的SH/SF共混水凝胶构建新方案。先对SH进行巯基化修饰得到巯基化透明质酸钠(MSH)。然后，利用辣根过氧化物酶(HRP)对MSH侧链上巯基之间以及SF侧链上酚羟基的双重介导作用，分别使MSH/SF共混体系中的MSH大分子之间形成MSH-MSH网络，SF大分子之间形成SF-SF网络，制备出共价交联的双网络MSH/SF水凝胶（简称双网络MSH/SF凝胶）。系统性地研究MSH/SF质量比对凝胶内部网络结构、孔结构、聚集态结构及凝胶粘弹性、吸水性、溶胀性、压缩性能、体外生物降解性能及细胞黏附、增殖性能的影响。并与经碳化二亚胺介导交联形成的单一混合网络水凝胶(简称单网络MSH/SF(C)凝胶）进行结构、理化性能及生物学性能的对比。最后，用“液氮急冻-粉碎法”造粒得到粒径为300-500μm的可注射微凝胶颗粒，将单网络和双网络MSH/SF微凝胶颗粒分别注入大鼠皮下，研究凝胶内部的单、双网络结构对体内生物降解速度、细胞浸润、组织新生及炎症反应的影响。 首先，通过HRP对MSH侧链上接枝的巯基和SF侧链酪氨酸残基上的酚羟基进行双重介导交联，“一步法”制备出双网络MSH/SF共混水凝胶。当MSH/SF质量比为50/50时，MSH和SF两种组分能明显地抑制对方的自聚集，使体系内两种组分均匀分散。荧光标记后的观察结果表明此时MSH-MSH网络和SF-SF网络相互渗透和穿插，形成最明显的双网络结构。红外光谱分析结果显示MSH/SF共混凝胶中MSH大分子之间以二硫键相连接，SF大分子之间以二酪氨酸键相连接。微商热重分析也从侧面佐证了MSH和SF能够相互抑制对方的聚集并形成双网络结构。随着MSH/SF质量比的减小，共混凝胶的亲水性、溶胀率下降，孔径减小，孔隙率增大。MSH-MSH和SF-SF双网络结构的形成能够显著提高单一组分MSH凝胶或SF凝胶的压缩强度和压缩模量。 其次，考察共混凝胶中MSH/SF质量比对凝胶体外降解速率和细胞相容性的影响。结果表明，凝胶中的MSH-MSH网络和SF-SF网络形成的双网络结构对MSH和SF两种组分具有一定的保护作用。当MSH/SF质量比为50/50时，能明显减慢双网络凝胶在PBS缓冲液、透明质酸酶溶液、Ⅰ型胶原酶溶液中的体外降解速度。此时，MSH对SF的分子构象从无规卷曲向β-折叠转变的抑制作用最为显著。随着MSH/SF质量比的减小，即SF占比的增大，共混凝胶对小鼠成纤维细胞(L929)和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的黏附性能均明显提高，细胞铺展更充分，细胞增殖活力显著提高。 然后，将MSH/SF质量比均为50/50的双网络凝胶与单网络凝胶进行结构、性能对比。结果表明，相对于单网络水凝胶MSH/SF(C)，双网络水凝胶MSH/SF内部的孔隙率增大，压缩强度、压缩模量、储能模量G''均显著提高，体外生物降解速度显著减慢，促进L929增殖的能力增强。 随后，通过“液氮急冻-粉碎法”制备出粒径分布主要在300-500μm范围内的单、双网络微凝胶，通过与人脂肪间充质干细胞共培养，研究单、双网络微凝胶对干细胞的黏附、增殖和生长的影响。结果表明，相对于单网络微凝胶MSH/SF(C)，双网络微凝胶MSH/SF更有利于干细胞的黏附、铺展以及引导干细胞在凝胶内部的均匀分布。研究发现，相对于裸细胞直接注射，双网络微凝胶MSH/SF能为细胞提供物理保护，显著维持干细胞的增殖活力。 最后，通过将单、双网络微凝胶植入大鼠皮下，考察单、双网络结构对凝胶体内降解性能、细胞浸润、组织再生及炎症反应的影响。结果表明，与单网络微凝胶MSH/SF(C)颗粒植入体内2周时已因降解而崩溃，并在4周时已完全被生物降解不同，双网络微凝胶MSH/SF在植入体内8周的整个实验周期内，能够始终基本保持原有的颗粒形貌，未发生因降解而造成凝胶颗粒崩溃的现象，其体内生物降解速率显著慢于单网络微凝胶。在双网络微凝胶MSH/SF植入体内4周内，细胞和组织不仅能够沿着微凝胶颗粒之间的缝隙生长，而且能够向微凝胶颗粒内部浸润，并沉积胶原蛋白。各组微凝胶植入体内后炎症反应均较轻，1周后炎症相关因子TNF-α和IL-6的阳性表达率均逐步下降，4周后均达到较低水平，且凝胶周围的包囊完全消失。上述研究结果证明，双网络微凝胶MSH/SF在体内不仅能够持续地抵御生物降解，而且具备良好的组织相容性，显示出用于软组织修复的潜力。 本文利用HRP对MSH侧链上巯基和SF侧链上酪氨酸残基上的酚羟基的双重介导作用，构建具备双网络结构的MSH/SF共混凝胶。研究结果表明，凝胶内部MSH-MSH网络和SF-SF网络充分渗透后具有相互保护效应，能够显著增强凝胶的生物稳定性。相对于单网络水凝胶，其力学性能显著提高，体外、体内降解速率明显减慢。双网络水凝胶中的SF组分和凝胶内部的高孔隙率能显著增强宿主细胞在凝胶内的黏附、增殖和组织浸润，加速胶原沉积。MSH/SF微凝胶具备良好的体外、体内生物相容性。上述研究结果为用于软组织修复的新型微凝胶的开发和临床应用提供了系统性的实验依据。
NETL