摘要
在近 30 年中，随着转基因技术的日益成熟，单抗性转基因农作物已相继投入商业化生产应用，例如转Bt抗虫棉花和玉米、转EPSPS抗草甘膦大豆等在世界各地已广泛种植，并产生了巨大的经济效益。随着这些转基因作物的大规模推广，一些潜在的问题也陆续浮出表面，例如，棉铃虫危害减轻了，但蚜虫、飞虱等刺吸式害虫的危害逐渐加重；转 Bt 抗虫棉花不抗黄萎病也不耐旱耐盐碱等。农作物在生长过程中，不会只受一种胁迫影响，而是三者甚至更多逆境因子的综合，因此，培育多抗性的转基因作物是发展方向也是生产迫切需求。 本研究尝试构建一个含 7 个外源抗性基因的植物表达载体，其中所采用的抗旱耐盐碱基因NhaD是从我国西北柯柯盐湖的中度嗜盐菌分离出来的，它编码一个Na+/H+逆向转运蛋白。抗病基因则使用了鸡蛋清溶菌酶 (HEWL) 和天麻抗真菌蛋白 (GAFP) 双基因，其中鸡蛋清溶菌酶是典型的c型溶菌酶，能水解细菌和真菌病原细胞壁，而天麻抗真菌蛋白则可以提供广谱真菌活性。抗除草剂基因则使用了 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶 (CP4-EPSPS) 和草甘膦 N-乙酰转移酶 (GAT) 双基因，二者同时转入植物可显著提高受体作物的草甘膦抗性。抗虫基因则选择使用了雪花莲凝集素 (GNA) 和尾穗苋凝集素 (ACA) 双基因，它们可提供对蚜虫、飞虱等刺吸式害虫的抗性。作为一种糖蛋白，可以与昆虫消化道的上皮细胞可逆结合。从而达到抑制昆虫迫害的作用。 使用2A多肽表达策略，本研究首先将NhaD、HEWL、GAFP、GAT和CP4-EPSPS基因依次串联在一起，然后置于质体蓝素启动子调控之下启动，将GNA与ACA通过2A多肽串联起来，置于35S启动子调控之下，上述两个外源基因表达框被同时插入到pBI121起始质粒中，并替代原GUS基因表达框，由此构建成一个含7个外源基因的植物表达载体pBI121-7g。将HEWL和 GAFP 基因通过 2A 多肽连接在一起，由 35S 启动子启动，构建成一个双价植物表达载体pBI121-HEWL-GAFP (pBI121-HG)。将GAT和CP4-EPSPS基因通过2A多肽连接在一起，由35S启动子启动，构建成另外一个双价植物表达载体pBI121-GAT-CP4-EPSPS (pBI121-GC)。 通过农杆菌叶盘转化法，将上三个植物表达载体分别转入烟草和棉花中。利用 CP4-EPSPS试纸条以及基因组PCR的方法筛选鉴定阳性植株。通过CP4-EPSPS试纸条以及基因组PCR的方法筛选鉴定阳性植株，七个基因均为阳性的转基因烟草植株60棵，分别用基因组PCR的方法检测了20棵，检测出12棵阳性，用CP4-EPSPS试纸条检测50棵，检测出38株阳性，同时也将但抗性双基因分别单独转化到烟草中，转HEWL、 GAFP双基因的烟草再生植株利用基因组PCR的方法检测再生植株30株，得到23棵阳性植株，检测转GAT、CP4- EPSPS双基因的烟草再生植株45棵，采用基因组PCR的方法检测10株，得到7棵阳性植株，用CP4-EPSPS试纸条检测35棵植株，得到30棵阳性。通过实时荧光定量PCR (Qantitative real-time PCR，qPCR) 检测到不同转基因株系外源基因的转录水平，Western Blot 技术鉴定目的蛋白已表达，利用酶联免疫吸附测定 (ELISA) 测定外源基因蛋白在转基因植物中表达含量。经过生物学抗性检测比较发现2A多肽融合多基因在植物中表达不会降低其抗性。
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