摘要
蜱， 俗称蜱虫，属于体外专性吸血性寄生虫，是仅次于蚊子的第二大媒介。它传播的病原种类可达数百种，而很多病原是人兽共患病病原。其中，唾液腺是蜱虫吸血和传播病原的重要器官。已有研究表明，蜱虫饱血后唾液腺短期内发生急剧退化消亡；蜕皮激素（20E）在唾液腺退化过程中起到了非常重要作用。然而，20E调控蜱唾液腺退化的分子作用机制未知。本文以镰形扇头蜱雌蜱为研究对象，以蜕皮激素受体为研究目标，聚焦雌蜱唾液腺退化过程，从分子水平来阐明蜕皮激素受体在雌蜱唾液腺退化过程中的分子作用机制，为蜱的新型防控策略提供理论基础。本论文的主要研究结果有以下几个方面： 一、功能性蜕皮激素受体基因的克隆和鉴定 根据本课题组镰形扇头蜱唾液腺转录组数据库信息，成功克隆出蜕皮激素受体（EcR）的 3个同源异构体分子，命名为RhEcR1、RhEcR2 和RhEcR3，分别含有1680bp核苷酸编码559个氨基酸、1362bp核苷酸编码453个氨基酸和1260bp核苷酸编码419个氨基酸，预测分子量分别为61.29KD、51.22KD和47.25KD；超气门蛋白（USP）的2个同源异构体，命名为RhUSP1和RhUSP3，分别含有1308bp核苷酸编码435个氨基酸和1200bp核苷酸编码399个氨基酸，预测分子量分别为 48.17KD 和 44.4KD。经序列比对，RhEcRs 和 RhUSPs 均含两个保守的结构域， DNA结合结构域（含有两个保守性的C4锌指结构）和配体结合结构域。它们均属于核受体转录因子家族成员，各同源异构体之间区别仅在于氨基端高可变性的转录激活区；在不同蜱种中保守性较高。 二、功能性蜕皮激素受体的表达特征及对蜱的生物学影响 雌蜱多组织器官中均有RhEcR/RhUSP的表达，如唾液腺、肠、卵巢、脂肪体和颚下神经节。饱血后，RhEcR/RhUSP在唾液腺、肠和卵巢中的转录表达水平明显高于脂肪体和颚下神经节。唾液腺中 RhEcR/RhUSP 的转录表达量在高速退化阶段达到顶峰，而卵巢中 RhEcR/RhUSP 的转录表达一直处于较高水平。唾液腺中20E浓度在快速吸血初期急速上升直至饱血当天达到顶峰并随着退化的进行而降低，而唾液腺所在环境血淋巴中20E浓度从快速吸血期到唾液腺退化或者卵巢发育完全时均处于较高水平。蜕皮激素受体广泛存在于雌蜱各组织器官中，但表达特征相异。体内进行RhEcR/RhUSP、RhEcR及RhUSP分别敲低后显示：RhEcR和RhUSP两个基因均能很好地被显著性敲低；RhEcR基因单独被敲低和RhEcR/RhUSP两基因同时被敲低后表型一致；RhEcR被显著性敲低后可以明显抑制雌蜱吸血，使得雌蜱吸血停滞在快速吸血初期从而不能饱血，更不能产卵；RhUSP基因单独被敲低、不相关基因被敲低及没有进行基因敲低正常发育繁殖雌蜱的表型一致，没有出现异常吸血现象且可以正常发育和繁殖；形态学显示唾液腺组织分化和重塑受到抑制即唾液腺退化受阻。 三、蜕皮激素受体在蜱唾液腺退化中的作用机制研究 唾液腺中RhEcR基因转录水平被显著性敲低了54%，细胞凋亡通路上的Caspases的表达也显著性降低，表现为RhEcR干扰组唾液腺中RhCaspase7，8，9被显著性敲低，转录表达水平分别是对照组的12.9%、34.17%和8.70%。这很大程度上阻止RhCaspases依赖的细胞凋亡发生，从而使得唾液腺组织不能正常退化。同时，雌蜱唾液腺中RhEcR基因被显著性敲低后，转录组学和蛋白质组学均显示内在细胞凋亡途径中相关因子的表达被显著性被抑制，如RhBcL2、RhCyt C和RhCaspase7等。透射扫描电镜显示RhEcR基因被显著性敲低后唾液腺中线粒体数量及膜结构细胞器显著性减少，进一步表明RhEcR影响唾液腺退化过程中内在细胞凋亡过程。 （四）蜕皮激素受体通过调控转录因子RhFOXO介导唾液腺的退化 RhEcR基因被显著性敲低后，调控细胞凋亡的转录因子 RhFOXO也显著性降低。根据镰形扇头蜱唾液腺转录组数据库信息，仅克隆出了一个RhFOXO分子，这一点不同于哺乳动物有多个FOXO基因，但与节肢动物中仅有一个FOXO基因的理论相符合。体内显著性敲低RhFOXO基因后吸血缓慢、饱血时间显著性延后、饱血重量显著性增加、产卵率和孵化率显著性降低；形态学显示唾液腺组织的分化和重塑明显被延缓；同时RhPI3K、RhPDK1、RhAKT、RhBcL2、RhCyt C和RhCaspase7在退化前期显著性降低，正常退化后期（E96h）RhEcR、RhUSP、RhPI3K、RhPDK1、RhAKT和RhCyt C突然显著性升高而RhCaspase9显著性降低，以上推断RhEcR通过转录调控RhFOXO来调控内在细胞凋亡过程。然而，由于蜱源细胞系和相关特异性抗体的缺乏，目前只能推断在唾液腺退化中RhEcR调控转录因子RhFOXO介导的内在细胞凋亡过程，但直接调控还是间接调控未知。 （五）RhEcR和RhUSP间的相互作用 鉴于蜱源细胞系和相关特异性抗体的缺乏，无法在蜱体内去验证RhEcR与RhUSP的相互作用。根据其他节肢动物相关研究，可在哺乳动物细胞系HEK-293T中体外验证RhEcR和RhUSP的相互作用。研究发现：RhEcR各同源异构体可以分别与RhUSP各同源异构体相互作用。单个蛋白过表达显示，RhEcR各同源异构体长时间过表达可以引起细胞的死亡，但是RhUSP各同源异构体长时间过表达不能引起细胞死亡。然而，共同过表达结果显示24h内RhEcR1和RhUSP1组合可以促进细胞发生Caspase依赖的细胞凋亡。 综上所述，本研究克隆和鉴定了镰形扇头蜱功能性蜕皮激素受体5个相关分子，分别是RhEcR的3个同源异构体和RhUSP的2个同源异构体。功能性蜕皮激素受体广泛存在于雌蜱的各组织器官中且表达特征相异。RhEcR是雌蜱正常发育和繁殖所必须，RhEcR基因干扰后，雌蜱不能饱血、产卵。蜕皮激素受体RhEcR1和RhUSP1相互作用后形成的复合物可引起哺乳动物细胞发生细胞凋亡。RhEcR通过调控 RhFOXO 介导内在细胞凋亡过程来影响唾液腺退化。这些结果阐明蜕皮激素受体介导蜱唾液腺退化的分子机制，给蜱的新型防治策略提供了重要理论基础。
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