摘要
鱼肉富含蛋白质和不饱和脂肪酸，营养价值较高，是人类重要的动物源性食品来源之一。然而，有些鱼类含有毒素或其他对人体健康有害的物质，会引发健康风险。常引起食物中毒的鱼类有：鲀毒鱼、高蜡酯鱼(油鱼)和高组胺鱼等。目前，对于有毒鱼类的检测主要是基于其毒素或有害物质的检测，如色谱、质谱检测法等。这些方法操作复杂且耗时长，依赖于实验室及专业操作人员，不利于推广应用。同时，由于鱼体各组织器官毒素分布不一，采样部位的不同可能会导致检测结果的误差。DNA作为生物遗传物质，在同一生物中即使采样部位不同，DNA也完全一致，并且具有很好的稳定性，适用于加工及呕吐物，因此已成为食品鉴别的重要标志物。本研究以鲀毒鱼和油鱼为研究对象，开发了鱼肉 DNA快速提取方法，建立了基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification， LAMP)和重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)的有毒鱼类物种鉴定方法。主要研究内容和结论如下： (1)开发了鱼肉DNA快速提取方法。首先比较了五种去污剂的提取效果，选定提取效果较好的 SDS 和盐酸胍作为去污剂成分。接着利用正交实验对裂解液中的三羟甲基氨基甲烷、核酸酶降解液乙二胺四乙酸二钠、核酸稳定剂氯化钠的浓度进行优化，确定了最适浓度。最后进一步优化得到最佳样品量、最适的裂解液稀释倍数。开发出两种在15min内就能完成提取的裂解液及鱼肉DNA快速提取方法。 (2)建立了基于可视化及实时荧光 LAMP 技术的鲀毒鱼物种鉴定方法。选择常见的东方鲀属、叉鼻鲀属和刺鲀属鱼类为实验对象，分别针对16S核糖体RNA(16S rRNA)，细胞色素b(Cyt b)和细胞色素氧化酶亚基 I(COI)基因设计 LAMP 特异性引物，以常见的可食用鱼类，如鲤鱼、三文鱼、鳕鱼等作为阴性对照，进行特异性、灵敏度以及适用性研究。结果证明，设计的三种鲀毒鱼 LAMP 引物特异性良好，灵敏度较高。在实际样品检测中，大西洋真鳕作为被掺假样品，分别掺入 1%，20%和 50%的鲀毒鱼，经过水煮、烘烤以及人工胃液模拟消化处理后进行检测。结果表明，经过熟制加工与消化的掺假样品均能成功检测出鲀毒鱼成分，可满足水产品市场中鲀毒鱼掺假检测或鲀毒鱼中毒临床诊断的需求。 (3)开发了基于可视化和实时荧光LAMP技术以及RPA技术的油鱼物种鉴定方法。选择两种油鱼保守的Cyt b基因作为目标序列设计油鱼通用LAMP引物，结果证明，LAMP引物可同时扩增两种油鱼，而与其他鱼如鳕鱼等无交叉扩增，特异性良好，且能在 1h 内完成检测，基因组灵敏度达到 9.6pg/μL。在此基础上，进一步设计了异鳞蛇鲭与棘鳞蛇鲭的种特异性 RPA 引物，结果表明，种特异的引物可以鉴别两种油鱼，且与鳕鱼等其他鱼类无交叉扩增，具有良好的特异性以及基因组灵敏度。在鳕鱼中掺入不同比例的油鱼样品，并经过加工熟制和胃液模拟消化后，利用 LAMP及 RPA技术对其进行检测，结果表明低至 1%的油鱼掺假也能成功检出，具有实际应用价值。 本研究利用种属特异性 DNA标记，通过核酸等温扩增技术对鲀毒鱼和高蜡酯鱼进行物种鉴定，为市场中油鱼冒充鳕鱼现象的执法监管，以及避免鲀毒鱼或油鱼中毒和快速准确的中毒原因鉴定提供了重要的技术支撑。
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