摘要
血吸虫体被是其表层附着的一层合胞体，是雌雄虫相互接触、识别及信息物质传递交换的分界面，在雌雄虫相互识别、合抱及生长发育过程中可能发挥重要作用。本研究对日本血吸虫单性及双性感染 21 d 雌、雄虫的体被蛋白进行了分析，并对体被蛋白天冬氨酸氨基肽酶（Aspartyl aminopeptidase, AAP）生物学特性及相关功能进行了初步探究。 通过Real-time PCR技术对尾蚴性别进行鉴定，结合动物实验验证结果，确定只释放单性尾蚴的钉螺。将BALB/c小鼠分别感染单性尾蚴、双性尾蚴（双性感染），分别收集单性感染21 d雌、雄虫体及双性感染21 d的合抱虫体，并将合抱虫体雌、雄虫进行分离。然后，利用生物素-链霉亲和素纯化技术分离纯化虫体体被蛋白；应用非标记定量（Label free）蛋白质组学技术对单性的21 d雌（21dSF）、雄虫（21dSM）及合抱的21 d雌（21dPF）、雄虫（21dPM）体被蛋白进行鉴定及分析。结果显示：在 21 d 日本血吸虫雌虫组和雄虫组中共分别鉴定到 2888 个和 2878个体被蛋白。在 21 d 日本血吸虫雌、雄虫之间存在显著性差异的体被蛋白共有 224 个（Fold Change≥2, p-Value＜0.05），其中雌虫体被蛋白中上调表达的有147个，下调表达的有77个。对差异表达体被蛋白进行KEGG通路分析发现，上调蛋白主要参与谷胱甘肽分解代谢和氨基酸生物合成；而下调蛋白大多数参与DNA复制、剪接体和RNA降解等通路。进一步对特异体被蛋白进行筛选发现，雄虫、雌虫特异的体被蛋白分别为14个和18个，这些特异体被蛋白主要与细胞周期调节、基因转录、蛋白修饰与代谢、能量代谢相关；蛋白互作网络分析显示，其中六个特异体被蛋白可能存在相互作用，这些蛋白分子主要参与细胞周期调节、DNA 复制及泛素化蛋白修饰过程。与21dPM相比，21dSM中上调与下调表达的体被蛋白分别有155个和68个，其中21dSM和21dPM特异性表达的蛋白分别为43个和28个；特异蛋白主要聚类于跨膜转运、阳离子转运、ATP 代谢过程、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖代谢及生物合成过程等。与 21dPF 相比，21dSF 中上调和下调表达的体被蛋白分别有145和179个，其中21dSF和21dPF特异性表达的蛋白数分别为44个和43个；特异蛋白主要聚类于跨膜转运、DNA复制、mRNA剪接及NADP生物合成过程等。 根据日本血吸虫天冬氨酸氨基肽酶（SjAAP）的基因序列设计引物，以42 d日本血吸虫cDNA为模板扩增 SjAAP 基因，成功地构建了重组原核表达质粒 pGEX-4T-1-SjAAP，并在大肠杆菌（BL21）中进行表达。利用纯化的重组蛋白（rSjAAP）对BALB/c小鼠进行免疫，成功地制备出特异性针对 SjAAP 的多克隆抗体。Western blot 结果表明 rSjAAP 和虫体蛋白可以被制备的抗rSjAAP 血清识别；免疫组化结果显示，SjAAP 在日本血吸虫雌、雄成虫体被及实质皆有广泛分布。实时定量 PCR 分析结果显示，SjAAP 在所检测的虫体不同发育阶段及不同性别虫体中均有表达，且在8 d、14 d、21 d、28 d虫体内的表达水平较高，在虫卵、毛蚴及35 d虫体内的表达水平较低；在42 d雄虫中的表达水平要显著高于42 d雌虫（P＜0.01）。重组蛋白rSjAAP对特异性底物H-Asp-pNA的酶活性为4.45 U/mg；其酶促反应最大速率为0.018 mM·min-1，米氏常数为5.93 mM。将纯化的rSjAAP对BALB/c小鼠进行免疫保护实验，rSjAAP没有在小鼠体内诱导产生良好的免疫保护效果。 本研究对日本血吸虫单性及双性感染的21 d雌、雄虫体被蛋白进行了鉴定及分析，为探索日本血吸虫雌雄虫之间的相互识别、合抱及不同性别虫体生长发育过程的机制奠定了基础；此外，对体被蛋白SjAAP的基本特性及其在虫体中的生物学功能进行了探究。
NETL