摘要
本研究以裂殖壶藻藻株(Schizochytrium sp. ATCC20888)为对象，利用常压室温等离子体（Atmospheric room temperature plasma, ARTP）诱变技术及丙二酸、2,2’-联吡啶和丙二酸-2,2’-联吡啶复合筛选方法，获得DHA高产裂殖壶藻藻株，并在此基础上，利用扫描电镜、激光共聚焦显微镜及Omnilog表型分析系统对突变高产藻株及原始藻株的生长方式、油脂积累情况及其对不同营养底物的代谢能力进行比较，结合转录组学及代谢组学关联分析探究突变藻株的高产DHA机理。具体研究内容如下： 1. 利用ARTP诱变技术对裂殖壶藻进行诱变并采用丙二酸、2,2’-联吡啶及丙二酸-2,2’-联吡啶复合等方法进行藻株筛选，结果表明：丙二酸筛选、2,2’-联吡啶筛选及丙二酸-2,2’-联吡啶复合筛选均可以提高裂殖壶藻的平均DHA产量，极大地提高高产DHA藻株的筛选效率，筛选藻株较原始藻株DHA平均产量分别提高32.20%、25.01%和29.71%。复合筛选的突变藻株I-F-9，在250 mL发酵体系下的生物量、油脂产量及DHA产量分别达到38.82 g/L，19.94 g/L和10.88 g/L，其DHA产量及含量较原始藻株平均产量、含量分别提高了61.17%（P ＜ 0.05）和74.62%（P ＜0.05）。对突变藻株I-F-9进行连续诱变筛选，突变藻株B3的DHA产量及含量较原始藻株K2取得了进一步提升，分别提高了69.80%（P ＜ 0.05）和76.75%（P ＜ 0.05），其DHA产量达11.19 g/L，含量达61.72%。 2. 扫描电子显微镜（Scanning electron microscope, SEM）及激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, LSCM）结果显示：藻株细胞在整个发酵的过程中均以二分裂的方式进行增殖，突变藻株B3在48 h后胞内脂质开始融合增多形成更大的脂质体，同时，在72 h时较早的出现了孢子囊，较原始藻株K2其细胞增殖及油脂积累速率均明显升高。 3. Omnilog表型分析结果表明突变藻株B3和原始藻株K2均可利用PM生态板上的96种营养物质，与原始藻株K2相比，突变藻株B3对40种物质的代谢能力增强，其中最适底物是D-核糖。同时，常规饲料成分检测发现，突变藻株B3较原始藻株K2粗蛋白含量取得了明显提高，具有作为新型饲料添加剂的开发潜力。 4. 通过转录组学及代谢组学关联分析结果表明：突变藻株B3的能量代谢、核苷酸代谢及氨基酸代谢水平较原始藻株K2升高，胞内维生素C的合成明显增多，有效地降低了胞内的氧化损伤，有利于维持胞内的氧化-抗氧化平衡。此外，突变藻株B3胞体内的乙酰辅酶A合成酶等基因表达水平较原始藻株K2增加，促进了脂肪酸合成底物的合成。同时，脂肪酸合酶2（FAS2）的基因表达下调，但调控脂肪酸延长的FabG基因表达上调，使PKS途径较FAS途径对底物的竞争获得优势，从而使藻株在总油脂产量未发生明显变化的同时，DHA等长链不饱和脂肪酸产量及含量得到了明显提升。 本研究建立了裂殖壶藻的高效诱变筛选方法，成功获得了高产DHA裂殖壶藻突变株I-F-9和突变株B3，并开展了细胞生长及油脂积累观察、营养代谢、概略养分分析和多组学关联分析的研究，不仅为畜牧业新型饲料添加剂开发提供了一种新的资源，在藻株特性、DHA高产机制等基础研究和应用领域都具有重要意义。
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