摘要
苦味是雪茄烟的重要感官评价指标之一。苦味对雪茄烟的影响是双重的，苦味强度过小时，不能引起回甘效应，苦味强度过大时，会使抽吸时整体的舒适感、愉悦感下降。调控雪茄烟的苦味在一个合适的范围，制定苦味的合适范围，首先需要明晰雪茄烟叶中主要苦味物质。通过微生物对主要苦味物质的降解，以期在雪茄烟叶发酵过程中实现生物脱苦。本文综合应用感官评价、溶剂萃取、逐级分离、仪器分析、微生物降解等方法，对古引四号雪茄烟叶主要苦味物质组成进行初步分离鉴定，筛选出降解此物质的微生物并做相关研究。具体研究结果如下： （1）无水乙醇对烟叶所含物质进行初步提取，提取物经连续溶剂萃取（依次用正己烷、乙酸乙酯和水饱和正丁醇）分别得到馏分FⅠ、FⅡ、FⅢ和水相FⅣ，感官评价确定馏分FⅡ最苦。馏分FⅡ经大孔树脂分离得到5个馏分FⅡ-1~FⅡ-5，馏分FⅡ-2和FⅡ-3苦味强度较大。馏分FⅡ-2和FⅡ-3再分别经过硅胶色谱分离，得到馏分FⅡ-2-a~FⅡ-2-e和FⅡ-3-a~FⅡ-3-e。馏分FⅡ-2-b在其分离的5个馏分中苦味明显，馏分FⅡ-3分离得到5个馏分苦味都明显但苦味强度无差别。采用液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）对馏分FⅡ-2-b和馏分FⅡ-3组分鉴定，在正离子模式下，在馏分FⅡ-2-b和FⅡ-3总离子流色谱图的1.5min色谱峰被鉴定为烟碱。烟碱经过BitterX网站预测为苦味物质，且存在与BitterDB数据库中。烟碱在苦味馏分FⅡ-2-b和FⅡ-3的高比例（在馏分FⅡ-2-b占比42.04%，在馏分FⅡ-3占比18.07%），在加上自身低的苦味阈值（3.1mg/L），本研究认为烟碱是雪茄烟叶中主要的苦味化合物之一。当然，也不排除馏分中某些物质虽然含量较低，但可能阈值更低，造成苦味贡献度较大的情况。馏分中所检测出的2,3-联吡啶预测为苦味物质，而可替宁预测可能不是苦味物质。两种物质都不存在BitterDB数据库中。 （2）以主要苦味物质的烟碱为唯一碳源和氮源，从植烟土壤中分离筛选到了一株降解烟碱的细菌，结合形态学观察、生理生化研究和16SrDNA分子鉴定技术，确定该菌株属于节杆菌属（Arthrobacter），编号为D4。利用单因素实验方法，确定菌株D4降解烟碱的最适温度和pH分别为30℃和7。菌株D4在1g/L的烟碱浓度下具备较快的烟碱降解速率，培养18h时烟碱降解率可达到90%以上；在烟碱浓度≥4g/L时菌株生长受到明显抑制。菌株D4在1g/L烟碱培养基的摇瓶发酵过程中，随着发酵时间的增加，培养基的颜色会发生显著变化，从无色到蓝色，到墨绿色，到最后的浅黄色，表明菌株D4在降解烟碱过程中有明显的代谢产物变化。利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）检测四个阶段的培养基样品，发现该菌株降解烟碱过程中产生了新的终产物N-甲基吡咯烷酮、可替宁以及中间产物麦斯明，与目前报道的节杆菌属降解途径所产生的物质不同，推测D4可能存在新的降解烟碱的途径。 总之，烟碱在苦味馏分FⅡ-2-b和FⅡ-3的高比例，及其自身低的苦味阈值，本研究认为烟碱是古引四号雪茄烟叶中主要的苦味化合物之一。2,3-联吡啶预测为苦味物质，而可替宁预测可能不是苦味物质。菌株D4降解烟碱最适条件为1g/L的烟碱浓度，温度30℃，pH=7。菌株D4降解烟碱过程中产生了N-甲基吡咯烷酮、麦斯明和可替宁，有别于典型的吡啶代谢途径，推测该菌株可能存在新的烟碱降解途径。
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