摘要
猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus,PRV)导致的一类以猪流产和神经症状为主要特征的传染病.2011年以后,中国出现新的PRV变异株并迅速传播,传统的PRV基因缺失疫苗无法完全保护猪只免受变异株的感染,所以,研制PRV变异株疫苗尤为关键,本实验室研制了包含gE、TK、gI、us2与us9五基因缺失的活疫苗.国内生产的疫苗基本上都以PRVgE基因缺失为主,对猪群中PRVgE抗体水平检测可以鉴别诊断疫苗免疫与野生毒株感染.本课题围绕PRV单克隆抗体制备与PRVgE合成肽间接ELISA方法建立进行研究,以建立诊断gE抗体水平的ELISA方法. 1.PRV单克隆抗体制备 本研究采用超离纯化的PRVHeN1株病毒作为抗原对8周龄小鼠免疫三次,免疫完成后用血清检测为阳性的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合.使用间接免疫荧光方法筛选出18株阳性杂交瘤细胞,在此基础上通过在293T细胞中表达gE蛋白,并进行间接免疫荧光检测,进一步筛选出3株持续稳定分泌针对PRVgE蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为S-2B4、S-4B2、S-1H5.抗体亚类鉴定试剂盒鉴定S-2B4、S-4B2、S-1H5三株杂交瘤细胞株,三者重链均为IgG1亚类,轻链均为Kappa链.S-2B4、S-4B2、S-1H5株单抗制备的腹水效价分别为104.12、103.54、104.11.对筛选出来的三株单抗进行中和活性的鉴定,S-2B4与S-1H5具有中和活性且中和效价均为1∶32. 2.PRVgE合成肽间接ELISA方法的建立 分段表达PRVgE抗原区,通过Westernblotting,使用猪阳性血清对表达产物进行筛选,结果显示8个肽段可以与阳性血清反应,并通过公司合成抗原肽,我们使用间接ELISA方法,最终筛选出一段长度为15个氨基酸的肽段VD15作为间接ELISA抗原.利用合成肽作为包被抗原建立间接ELISA方法,对反应条件进行优化,最终选取Tris-HCl溶液作为最适包被液,37℃包被6h为最佳包被条件;选取1%酪蛋白为最佳封闭液;棋盘法确定最佳抗原包被浓度为1.5μg/孔、最佳血清稀释度1∶200;一抗(血清)最佳作用时间为30min;酶标二抗最佳反应时间为30min,最佳稀释倍数为1∶20000;TMB最佳显色时间为15min.由统计学计算规则,样本(S)OD450nm值gt;阴性样本(N)OD450nm值平均值(X)+3×SD时,便可认为99.9%几率上可判定为阳性(P),所以间接ELISA方法阴阳性临界值初步确定为OD450nm≥0.3判定为阳性样品;OD450nm值lt;0.30判定为阴性样品.批间重复实验与批内重复实验的变异系数CV%均小于10%,与PRRSV、HCV、PPV、ASFV和PCV2阳性血清没有交叉反应,显示出该方法具有良好的特异性与重复性.敏感性测试显示,中和抗体滴度为1∶8的PRV阳性血清稀释400倍时依然检测为阳性,表明该检测方法敏感性较高.与IDEXXPRVgE检测试剂盒进行对比,符合率为85%,表明本实验建立的检测方法与IDEXXPRVgE检测试剂盒有较好的一致性且具有一定的应用价值. 本实验制备的单抗为PRV的抗原与抗体检测提供了物质基础;建立的PRVgE间接ELISA方法可以对PRV野生毒株感染进行监测,具有一定应用价值.
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