摘要
非核糖体肽类天然产物具有复杂多变的结构和出色的生物活性，被广泛应用于医药、农业、食品等领域。传统天然产物研究方法缺乏精准识别多肽类物质的手段，无法实现新型非核糖体肽的定向挖掘。本研究综合运用多种现代质谱技术，结合层次聚类和分子网络等分析手段对真菌来源的非核糖体肽进行高通量筛选和去重复分析，发现了具有抗疟和抗菌活性的xylomyrocin类环缩肽和halovir类线性脂肽，并鉴定了它们的关键合成基因。随后根据骨架结构-质谱特征-合成基因三方关联信息定向挖掘了xylomyrocin类似物。具体研究结果如下： 1.借助MALDI-TOF质谱出色的高通量检测和层次聚类分析能力对1748株土壤来源丝状真菌进行快速的去重复筛选，从中确定了61个产生特征多肽的代表菌株。随后，利用这些特征多肽的UHPLC-HRESI-qTOF二级质谱信息构建分子网络，从70个多肽家族中识别了19个潜在的新型环肽家族。对其中一类环肽的产生菌Paramyrotheciumsp.XJ0827进行大规模发酵和质谱导向的分离纯化后获得了三个环肽单体化合物xylomyrocinsA–C（1–3）。最后，综合运用核磁共振、高分辨质谱、X射线单晶衍射等波谱解析手段鉴定1–3为结构中含有罕见D-木糖酸和特殊N-甲基氨基酸装配单元的10元环缩肽。 2.通过基因组测序和生物信息学分析，在Paramyrotheciumsp.XJ0827基因组中注释了98个与天然产物生物合成相关的基因簇，其中包含xylomyrocin的候选合成基因簇pxxmc。随后，通过基因敲除明确了pxxmc基因簇中编码NAD依赖脱氢酶的pxxmcE和编码非核糖体肽合成酶的pxxmcG是负责xylomyrocin生物合成的关键基因。最后，通过合成前体回补和稳定同位素标记实验推导了D-木糖酸特殊装配单元的来源和xylomyrocin的生物合成机制。 3.以pxxmcE和pxxmcG为探针在公开的真菌基因组中搜索同源基因，发现Paramyrothecium和Colletotrichum属真菌含有与pxxmc高度相似的生物合成基因簇。通过收集50株Paramyrothecium和Colletotrichum属真菌，在不同培养条件下发酵后，经MALDI-TOF质谱检测发现ParamyrotheciumroridumNRRL2183、P.roridumMN113194、Colletotrichumsp.XJ1040等7株真菌能够产生10类不同的多肽类代谢产物。进一步比较xylomyrocin和这些多肽的二级质谱裂分特征，确定了其中三类多肽是xylomyrocin的结构类似物。最后，通过大规模发酵、定向分离和结构鉴定，获得了xylomyrocinsD–L（4–12）。生物活性实验结果显示，部分xylomyrocins对恶性疟原虫具有明显的生长抑制作用，其中化合物1和11的活性最强，IC50值分别达到13.5和10.0μM。 4.通过MALDI-TOF质谱发现P.roridumNRRL2183除了合成xylomyrocin类环缩肽外，还产生3个非核糖体肽类化合物（29–31）。对其进行定向分离和结构鉴定，确定化合物29–31是具有N-端月桂酰基修饰和2-氨基异丁酸特殊装配单元的帕博霉素类线性六肽，命名为halovirsI–K。化合物29和30对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌具有显著的生长抑制活性，MIC值分别均为20μg/mL。另外29和30能够明显抑制人肺癌A549细胞、人宫颈癌Hela细胞以及人乳腺癌MCF-7细胞的增殖，IC50值为1.3–3.3μM。最后，通过生物信息学分析确定了halovirs的生物合成基因簇prhal，发现非核糖体肽合成酶PrHalA在装配halovir的过程中存在反式上载底物的现象。 综上所述，本论文建立了基于现代质谱技术的真菌非核糖体肽挖掘平台，发现了两类具有抗疟和抗菌活性的新型非核糖体肽xylomyrocin和halovir，并对二者的生物合成机制进行了解析。随后，根据骨架结构-质谱特征-合成基因三方关联信息定向挖掘了xylomyrocin结构类似物，拓展了该类新骨架环缩肽的结构多样性。研究结果不仅为挖掘真菌非核糖体肽提供了新方法，而且为抗疟和抗菌药物的创制提供了新型先导化合物。
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