摘要
目的：利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）感染人牙髓细胞（Humandentalpulpcells，hDPCs）建立炎症模型，探讨连接蛋白（Connexin，Cx）43在该环境下与自噬的联系以及其对人牙髓细胞成牙本质分化的作用和机制研究。 方法：1.通过免疫荧光染色法（Immunofluorescence，IF）观察离体牙在不同感染状态下Cx43和轻链3（Lightchain3，LC3）的表达变化；Microarray筛选出牙髓炎中表达变化明显的自噬相关因子并通过实时荧光定量PCR（Real-timePCR，RT-PCR）进行验证。2.采用胶原酶消化法培养hDPCs进行后续相关实验；采用10.0μg/mlLPS对hDPCs施以0-24h刺激，RT-PCR检测Cx43、自噬相关因子（Autophagyrelated，ATG）ATG2、ATG4、ATG5、ATG12、ATG16、unc-51样自噬激活激酶1（ULK1）、自噬效应蛋白（Beclin1，BECN1）、LC3和成牙本质分化相关因子Runt相关转录因子2（Runx2）、成骨细胞特异性转录因子（Osterix）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、牙本质基质蛋白-1（DMP-1）和碱性磷酸酶（ALP）mRNA的表达变化来确定后续试验最佳的LPS作用时间；构建Cx43基因沉默慢病毒载体用于感染hDPCs干扰Cx43表达，施以LPS刺激以体外模拟牙髓感染，通过RT-PCR和IF检测成牙本质分化因子的表达，RT-PCR和蛋白质印迹法（WesternBlot，WB）检测自噬相关因子表达变化。3.采用1μMLYN-1604（ULK1激动剂）预处理siRNA-Cx43hDPCs24h，随后施以LPS处理hDPCs6h，RT-PCR和IF检测成牙本质分化因子的表达水平变化，明确Cx43调控hDPCs成牙本质分化的机制；分别采用100μMGap19（Cx43介导的HC选择性通道抑制剂）和100μM18-α-glycyrrhetinicacid（Cx43介导的GJC化学通道抑制剂）预处理hDPCs1h，随后施以LPS刺激6h，RT-PCR和WB检测成牙本质分化相关因子的表达水平变化，确定Cx43调节hDPCs成牙本质分化功能实现的途径。 结果：1.IF结果显示，浅龋时Cx43和LC3表达水平轻微上调，随着牙髓感染程度加重，Cx43表达逐渐增高且向胞膜表达明显增强，LC3表达上调发生明显核内转移。Microarray结果显示，在牙髓感染后表达变化明显的自噬相关因子有：ATG2、ATG4、ATG5、ATG12、ATG16、ULK1、BECN1和LC3，与RT-PCR验证结果一致。2.胶原酶消化法体外成功培养原代hDPCs，选择传代后第3-6代细胞用于后续实验。RT-PCR结果显示，当LPS刺激hDPCs6h时，Cx43与自噬相关因子表达最高且显著抑制成牙本质分化；故后续实验采用10.0μg/mLLPS刺激时间为6h。Cx43沉默慢病毒转染（MOI=40，5.0μg/mLPolybrene）hDPCs，48-72h后可观察到绿色荧光表达，RT-PCR和WB检测hDPCs中Cx43的表达均下降；RT-PCR和WB结果显示，正常和LPS刺激下，抑制Cx43表达显著上调Runx2、DSPP等成牙本质分化相关因子表达水平，同时下调ATG16、LC3等自噬相关因子的表达；IF结果显示，Osterix表达于细胞核内，抑制Cx43显著增强正常培养和LPS刺激的hDPCs胞核内Osterix染色强度；DSPP主要表达于细胞质内，染色结果与Osterix相似。3.使用LYN-1604预处理hDPCs刺激自噬反应，RT-PCR和IF结果显示，增强了LPS对成牙本质分化的抑制作用，减弱了抑制Cx43对细胞分化的促进作用；使用Gap19和18-α-glycyrrhetinicacid预处理hDPCs，RT-PCR和WB结果显示，施加Gap19能逆转LPS对Runx2、DSPP等成牙本质分化因子表达的抑制，与抑制Cx43表达效果一致，而施加18-α-glycyrrhetinicacid并未明显上调Runx2、DSPP等成牙本质分化因子的表达，表明Cx43减弱hDPCs自噬水平并促进成牙本质分化是通过抑制其介导的HC活性实现。 结论：本研究表明，Cx43和自噬均参与了牙髓的炎症和修复反应过程。10.0μg/mLLPS刺激6h上调hDPCs内Cx43与自噬相关因子的表达水平，激活了Cx43介导的HC活性和自噬反应，阻碍hDPCs的成牙本质分化；抑制Cx43表达能够下调LPS诱导的自噬反应，促进hDPCs的成牙本质分化；Cx43减弱hDPCs自噬水平并促进成牙本质分化是通过抑制其介导的HC活性实现，而不是GJC。
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