摘要
目的:通过卤醇脱卤酶的筛选、生物转化条件优化和底物拓展,建立卤醇脱卤酶催化环氧化物合成手性噁唑烷酮的生物催化路线. 方法: (1)以实验室保藏的卤醇脱卤酶基因工程菌为酶库,分别以环氧苯乙烷(芳香族环氧化物)和1,2-环氧-3-甲基丁烷(脂肪族环氧化物)为模板底物,筛选可立体选择性和区域选择性催化环氧化物合成对应噁唑烷酮化合物的卤醇脱卤酶工程菌. (2)以模板生物转化反应为基础,对目标卤醇脱卤酶催化环氧化物合成对应噁唑烷酮化合物的生物转化条件进行优化,建立卤醇脱卤酶合成噁唑烷酮最适生物催化条件. (3)通过不同类型底物拓展,建立卤醇脱卤酶催化环氧化物合成手性噁唑烷酮的生物催化技术路线. 结果: (1)以环氧苯乙烷为模板底物,通过系列卤醇脱卤酶的筛选,发现HheC可催化环氧苯乙烷合成5-苯基噁唑烷酮,产率为18%,(R)-立体选择性为95%.条件优化研究表明HheC合成5-苯基噁唑烷酮的最适反应温度为45℃,最适pH为7.0,底物浓度为30mM,细胞浓度为15gcdw/L,最适反应时间为12h,最适亲核试剂浓度为90mM,在此条件下可获得39%的产率和88%ee值的5-苯基噁唑烷酮,β-区域选择性为65%.底物拓展实验表明,HheC可催化芳香烃取代环氧化物1a-1i合成对应的(R)-5-取代噁唑烷酮2a-2i,收率为32~47%,ee值为73~91%. (2)以环氧苯乙烷为模板底物,通过系列卤醇脱卤酶的筛选,发现HheG可催化环氧苯乙烷合成4-苯基噁唑烷酮,产率为32%,(R)-立体选择性为78%.条件优化研究表明HheG合成4-苯基噁唑烷酮的最适反应温度为30℃,最适pH为7.5,底物浓度为30mM,细胞浓度为15gcdw/L,最适反应时间为12h,最适亲核试剂浓度为90mM,在此条件下可获得77%的产率和21%ee值的4-苯基噁唑烷酮,α-区域选择性为gt;99%.底物拓展实验表明,HheG可催化芳香烃取代环氧化物1a-1i合成对应的4-取代噁唑烷酮3a-3i,收率为46~77%,ee值为1.0~30%. (3)以1,2-环氧-3-甲基丁烷为模板底物,通过系列卤醇脱卤酶的筛选,发现HheA10可催化1,2-环氧-3-甲基丁烷合成5-异丙基噁唑烷酮,产率为12%,(S)-立体选择性为92%.条件优化研究表明HheA10合成5-异丙基噁唑烷酮的最适反应温度为35℃,最适pH为6.5,底物浓度为20mM,细胞浓度为15gcdw/L,最适反应时间为6h,最适亲核试剂浓度为120mM,在此条件下可获得35%的产率和92%ee值的5-异丙基噁唑烷酮,β-区域选择性为gt;99%. (4)以1,2-环氧-3-甲基丁烷为模板底物,通过系列卤醇脱卤酶的筛选,发现HheG可催化1,2-环氧-3-甲基丁烷合成5-异丙基噁唑烷酮,产率为9%,(R)-立体选择性为91%.在HheG对环氧苯乙烷的最佳条件下优化底物浓度和反应时间,实验表明HheG合成5-异丙基噁唑烷酮的最适底物浓度为15mM,最适反应时间为6h,在此条件下可获得30%的产率和90%ee值的5-异丙基噁唑烷酮,β-区域选择性为gt;99%. 结论: 通过卤醇脱卤酶的筛选、条件优化和底物拓展,建立以下卤醇脱卤酶合成手性噁唑烷酮的生物催化技术路线: (1)卤醇脱卤酶HheC可以催化芳香族取代的环氧化合物1a-1i合成对应的(R)-5-取代噁唑烷酮2a-2i,收率为32~47%,ee值为73~91%. (2)卤醇脱卤酶HheG可以催化芳香族取代的环氧化合物1a-1i合成对应的4-取代噁唑烷酮3a-3i,收率在46~77%,但立体选择性较差,ee值为1~30%. (3)卤醇脱卤酶HheA10可以催化脂肪族取代的环氧化物1,2-环氧-3-甲基丁烷合成对应的(S)-5-异丙基噁唑烷酮,产率为35%,ee值为90%. (4)卤醇脱卤酶HheG可以催化脂肪族取代的环氧化物1,2-环氧-3-甲基丁烷合成对应的(R)-5-异丙基噁唑烷酮,产率为30%,ee值为90%.
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