摘要
亚临床酮病（Subclinicalketosis,SCK）是高产奶牛围产期常见的营养代谢病。尽管同期发情-定时输精技术已在规模化牧场中得到广泛应用，但部分SCK奶牛经同期发情-定时输精处理后仍缺乏发情表现。因此，高产奶牛SCK导致的乏情率升高已成为国内外代谢和繁殖领域亟待解决的重大问题。针对这一临床实际问题，本研究通过体内试验进行SCK乏情（SCK-anestrus,SCK-A）奶牛血浆代谢物、激素、肝功能指标和最大卵泡直径的跟踪检测以及肝脏组织的蛋白质组学分析。随后，本研究通过体外实验探究关键差异表达蛋白（Differentiallyexpressedprotein,DEP）视黄醇结合蛋白4（Retinolbindingprotein4,RBP4）对非酯化脂肪酸（Non-esterifiedfattyacids,NEFA）培养条件下奶牛卵泡颗粒细胞（Folliculargranulosacells,FGCs）增殖、凋亡和类固醇激素合成的影响。本研究旨在：（1）阐明代谢和激素紊乱以及肝功能损伤与SCK和产后乏情的关系；（2）明确SCK-A奶牛的蛋白质组学变化特征，以及RBP4与SCK和产后乏情的关系及其对SCK奶牛产后乏情的早期预警和监测作用；（3）揭示RBP4影响奶牛卵泡生长发育的分子机制。为今后进一步深入研究奶牛SCK导致乏情的机制提供理论依据。 （1）本试验通过对围产期健康对照（Healthycontrol,HC）奶牛[β-羟丁酸（β-hydroxybutyrate,BHBA）lt;1.20mM,n=61]和SCK奶牛（1.20mM≤BHBA≤2.90mM且无临床酮病症状，n=57）的调查研究，以及HC发情（Healthycontrol-estrus,HC-E）奶牛（n=15）和SCK-A奶牛（n=15）血浆代谢物、激素和肝功能指标和最大卵泡直径的跟踪检测，结合独立样本t检验、卡方检验、二元Logistic回归分析和重复测量的方差分析。结果显示：本试验选取的SCK奶牛呈现严重的能量负平衡、脂肪组织过度动员和产奶量低的特征。与HC组奶牛相比，SCK组奶牛首次发情天数、发情周期、产犊间隔、配准天数和输精次数极显著增加（Plt;0.01），发情率和受胎率极显著降低（Plt;0.01），产后乏情的风险提高5.641倍（OR=6.641,P=0.023）。与HC-E组奶牛相比，SCK-A组奶牛产后21d血浆BHBA、NEFA、甘油三酯、天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、谷氨酰转移酶和总胆红素水平显著升高（Plt;0.05），胰岛素、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子结合蛋白-3、葡萄糖（Glucose,Glu）、总胆固醇、白蛋白和总蛋白水平极显著降低（Plt;0.05）。这些变化会一直持续到产后55~60d（Plt;0.05），导致SCK-A组奶牛血浆雌二醇（Estradiol,E2）、孕酮（Progesterone,P4）水平和卵泡生长速度显著低于HC-E组奶牛（Plt;0.05）。组织学分析显示，SCK-A奶牛存在明显的肝脏脂肪变性。 （2）本试验通过对HC-E奶牛（n=6）和SCK-A奶牛（n=6）肝脏组织的TMT蛋白质组学分析，结合生物信息学分析和统计学分析。结果显示：与HC-E组奶牛相比，SCK-A组奶牛肝脏组织中39个DEPs下调，41个DEPs上调（FCgt;1.2,Plt;0.05）。其中，下调DEPs主要富集在色氨酸代谢、细胞色素P450对异生素的代谢和糖酵解／糖异生等通路；上调DEPs主要富集在矿物质吸收、自身免疫性甲状腺疾病和Ⅰ型糖尿病等通路。韦恩分析筛选出3个共同DEPs（RBP4、转甲状腺素和血清淀粉样蛋白P组分），且在SCK-A奶牛的肝脏组织、卵泡液和卵巢组织中均显著下调（Plt;0.05）。并且，其免疫印迹和ELISA结果均与各自的蛋白质组学结果趋势一致（Plt;0.01），验证了组学数据的准确性。同样，其血浆ELISA结果也与各自的蛋白质组学结果趋势一致，在围产期SCK-A奶牛血浆中显著降低（Plt;0.01），并延续至繁殖期（Plt;0.05）。Person相关性分析显示，产后21d血浆RBP4水平与围产期SCK（高BHBA、NEFA和低Glu水平）呈显著负相关（Plt;0.05），产后55d血浆RBP4水平与产后乏情（低E2、P4水平和卵泡生长速度）呈显著正相关（Plt;0.05）。ROC分析确立了产后21d血浆RBP4≤45.2μg/mL和产后55d血浆RBP4≤53.0μg/mL可分别用于SCK奶牛产后乏情的早期预警和监测。 （3）本试验通过体外培养奶牛FGCs，转染RBP4敲低腺病毒（Ad-shRBP4），结合免疫荧光、qRT-PCR、免疫印迹、CCK8、流式细胞术和放免检测以及单因素方差分析。结果显示：与阴性对照（Ad-GFP）组相比，Ad-shRBP4组FGCs的细胞活力、上清液中E2和P4含量以及FGCs中细胞周期蛋白（CyclinD1和CDK4）、抗凋亡蛋白Bcl-2、类固醇激素合成酶（StAR、CYP11A1、HSD3B1和CYP19A1）和PI3K/Akt和Erk1/2信号通路关键蛋白（p-PI3K、p-Akt和p-Erk1/2）的蛋白表达水平显著降低（Plt;0.05），FGCs的凋亡率和FGCs中细胞周期抑制蛋白（P27和P21）和促凋亡蛋白（Bax、Cytochromec和Cleavedcaspase-3）的蛋白表达水平以及Bax/Bcl-2的比值显著升高（Plt;0.05）。这些结果表明，RBP4可以调控奶牛FGCs增殖、凋亡和类固醇激素合成过程。采用0、0.6、1.2和1.8mMNEFA处理体外培养的奶牛FGCs。结果显示：NEFA可降低FGCs中RBP4的表达，之后呈现出与转染Ad-shRBP4后相同的结果。转染RBP4过表达腺病毒（Ad-RBP4）后，添加1.2mMNEFA。结果显示：RBP4过表达可以缓解NEFA对FGCs增殖、凋亡和类固醇激素合成的影响。这些结果表明，NEFA抑制RBP4的表达，随后抑制FGCs增殖和类固醇激素合成并诱导FGCs凋亡。转染Ad-RBP4后，分别添加PI3K抑制剂（20μMLY294002）和MEK抑制剂（50μMPD98059），添加1.2mMNEFA。结果显示：添加LY294002和PD98059均减弱过表达RBP4对NEFA负面影响的缓解作用，包括抑制FGCs增殖和类固醇激素合成以及诱导FGCs凋亡。 综上所述，围产期SCK是奶牛产后乏情的一个重要风险因素，其引起的代谢和激素紊乱以及肝损伤会延续至繁殖期，抑制卵泡的生长发育，从而导致奶牛产后乏情的发生。并且，肝损伤的延续改变了乏情奶牛的肝脏蛋白质组。其中，关键蛋白RBP4的循环水平降低，且与围产期SCK呈显著负相关，与产后乏情呈显著正相关，可用于SCK奶牛产后乏情的早期预警和监测。此外，RBP4通过PI3K-Akt和Erk1/2信号通路调控FGCs增殖、凋亡和类固醇激素合成过程，进而调控卵泡生长发育。
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