摘要
目的：探索在体内、外肾间质纤维化模型中，MSCs经半乳糖凝集素-3（Galectin-3，Gal-3）基因调控自噬抗纤维化的可能机制。 方法：体外实验：以人源重组TGF-β1(10ng/mL)细胞因子处理正常人肾小管上皮细胞(HK-2)48h，建立体外肾间质纤维化模型。实验分为7组，正常组、TGF-β1组、TGF-β1+MSCs条件培养基(MSCsConditionalMedium，MSCs-CM)组、TGF-β1+MSCs-CM+3-MA(自噬抑制剂，2mM)组、TGF-β1+MSCs-CM+MG-132(自噬激动剂，100nM)组、TGF-β1+3-MA组和TGF-β1+MG-132组。MSCs-CM、3-MA和MG-132均干预48h后，westernblot检测Gal-3/ULK1（Unc-51-likekinase1）/TRIM16（TheE3ligasetripartitemotif16）复合体、自噬、EMT（Epithelial-MesenchymalTransition）及ECM（Extracellularmatrix）的表达水平。为进一步探究在MSCs抗肾间质纤维化过程中，Gal-3基因调控对自噬和纤维化的影响，利用慢病毒载体构建人Gal-3敲低和过表达载体，分别建立Gal-3KD和Gal-3OE的HK-2工具细胞。分组同前，westernblot检测上述指标，空载病毒作为对照。为检测Gal-3表达与ULK1和TRIM16之间的互作关系，CoIP技术检测Gal-3与ULK1和TRIM16蛋白在TGF-β1诱导及MSCs干预后的结合情况。体内实验，雄性SD大鼠40只（220±20g），用含4.5%浓度腺嘌呤（Adenine）的生理盐水混悬液按照150mg/kg/d标准连续灌胃15天建立肾间质纤维化模型。根据随机数字表将大鼠随机分为5组，分别是正常组、Adenine组、Adenine+MSCs组、Adenine+柑橘果胶(Modifiedcitruspectin,MCP，Gal-3抑制剂)组、Adenine+MSCs+MCP组，建模的同时以0.1%浓度的MCP溶于饮用水给药，用量为100mg/kg/d，持续至取材前一天。建模结束后，尾静脉注射生理盐水MSCs（P3）细胞悬液(2×106个/kg)。收集血清检测肌酐、尿素氮评定肾脏功能；收集各组肾脏组织常规石蜡包埋切片后HE、Masson和SiriusRed染色检测病理状态；WesternBlot检测肾脏组织Gal-3/ULK1/TRIM16复合物、自噬、EMT及ECM的表达变化。 结果：1.在正常HK-2细胞中，用10ng/mLTGF-β1处理48h后，较正常组明显增加FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1和TRIM16蛋白表达，同时降低EMT标志物E-cadherin以及自噬标志物p62表达(Plt;0.05)。与TGF-β1组相比较，经MSCs-CM、3-MA或MSCs-CM+3-MA干预后，上述指标呈现相反趋势(Plt;0.05)，且MSCs-CM+3-MA较3-MA或MSCs-CM干预趋势更为显著(Plt;0.05)。 2.正常HK-2细胞，KD-con空载细胞和OE-con空载细胞之间，EMT和自噬核心指标α-SMA、E-cadherin、p62和LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达三组间均无显著统计学差异。 3.在Gal-3KD和Gal-3OEHK-2细胞的分组中，均与正常HK-2分组中呈现相同趋势，TGF-β1处理后均较对照组明显增加FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1和TRIM16蛋白表达，同时EMT标志物E-cadherin以及自噬标志物p62显著降低(Plt;0.05)；在MSCs-CM干预后，呈相反趋势(Plt;0.05)，且MSCs+3-MA组较MSCs-CM组FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1和TRIM16蛋白表达显著降低(Plt;0.05)，同时EMT标志物E-cadherin以及自噬标志物p62显著增高(Plt;0.05)；Gal-3KD组与Gal-3OE组相同亚组之间对比，Gal-3KD各亚组中FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1、TRIM16蛋白表达较Gal-3OE各亚组明显降低，同时EMT标志物E-cadherin以及自噬标志物p62显著增高(Plt;0.05)。 4.利用Gal-3抗体将与其结合的蛋白沉淀，结果显示TGF-β1相较于正常组，TRIM16和ULK1的表达增加(Plt;0.05)；与TGF-β1组比较，MSCs-CM干预后，与Gal-3结合的ULK1和TRIM16含量减少(Plt;0.05)。 5.在Adenine诱导建立肾纤维化模型后，HE、Masson、SiriusRed结果显示，Adenine组肾小管囊性扩张，炎性细胞浸润、肾脏损伤评分增大，肾间质细胞外基质成分胶原纤维增多(Plt;0.05)。而MSCs、MCP及其二者共同作用后，三个治疗组的大鼠肾脏损伤评分降低、肾小管间质中细胞外基质胶原成分降低(Plt;0.05)，且MSCs与MCP联用后SiriusRed显示胶原纤维降低更显著(Plt;0.05)。 6.肾脏组织WesternBlot结果显示，Adenine组大鼠肾脏组织中FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1和TRIM16较正常组大鼠肾脏组织上述蛋白表达明显增加，同时E-cadherin和p62蛋白表达显著降低(Plt;0.05)，而经MSCs、MCP和MSCs+MCP治疗后，大鼠肾脏组织中上述蛋白表达较模型组大鼠呈相反趋势(Plt;0.05)，且Adenine+MSCs+MCP组较Adenine+MSCs组与Adenine+MCP组的肾脏组织FN、COL1、α-SMA、ATG5、ATG7、LC3BⅡ/Ⅰ比值、Gal-3、ULK1和TRIM16较Adenine组蛋白表达明显增加，同时E-cadherin和p62蛋白表达显著降低(Plt;0.05) 结论：MSCs在体内、外实验肾间质纤维化模型中均显示较好的抗纤作用，其机制可能通过下调Gal-3/ULK1/TRIM16复合体的表达抑制自噬、抑制EMT而改善肾纤维化。
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