摘要
抗生素在防治人类和动物疾病，以及提高畜禽生产效率等方面给人类带来了巨大的医用和经济价值，但同时也带来了细菌耐药性、畜产品药物残留、过敏中毒反应等越来越多的问题。因此提供有效的抗生素替代技术支持十分迫切。 抑菌蛋白是一类具有抗菌活性的蛋白质或多肽物质，主要包括动植物及微生物来源的溶菌酶、抗菌肽等，被认为是最具应用潜力的抗生素替代品之一。抑菌蛋白多数具有热稳定性好、抗菌谱广、不易产生耐药性等特点。目前抑菌蛋白在微生物表达系统中的生产存在表达量低、容易被降解、不易检测和得率低等问题，严重阻碍其研究及推广应用。为了提高抑菌蛋白的表达量和抑菌能力，微生物高效表达的方式越来越受到研究人员的关注。本研究以蛋清溶菌酶、防御素Pletasin和人源颗粒溶素Granulysin（GNLY9）3种抑菌蛋白作为研究对象，通过融合高表达的载体蛋白，并在融合蛋白之间引入毕赤酵母内源蛋白酶酶切位点，在提高表达量的同时又能使融合蛋白在细胞内被切割成独立发挥作用的活性蛋白，为溶菌酶、防御素和颗粒溶素等在毕赤酵母表达系统中难表达、不易检测表达情况的蛋白提供了一种新的表达策略。 本论文将蛋清溶菌酶HEWL按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，分别构建了HEWL单独表达载体pPIC9K-Hewl，以及与木聚糖酶XynCDBFV融合的表达载体pPIC9K-XynCDBFV-Hewl，研究结果显示，经过G418抗生素筛选、摇瓶诱导表达、溶菌酶酶活测定、抑菌圈直径测定，发现HEWL与木聚糖酶XynCDBFV融合的表达量约为单独表达HEWL的10倍。通过15L发酵罐高密度发酵，168h时溶菌酶酶活达到1.50×105U/mL，是目前已报道的最高水平。 本论文将真菌来源的防御素Pletasin与木聚糖酶进行融合表达，构建了融合表达载体pPIC9K-XynCDBFV-Pletasin，研究结果显示，木聚糖酶的酶活与防御素Pletasin的表达呈正相关，通过木聚糖酶酶活对获得的转化子进行筛选，获得了能同时高表达木聚糖酶XynCDBFV与防御素Pletasin的菌株，防御素的蛋白表达量约为2g/L，具有很高的应用价值。 本论文分别构建了颗粒溶素GNLY9的单独表达载体pPIC9K-GNLY9，以及木聚糖酶XynCDBFV，SUMO与颗粒溶素GNLY9的融合表达载体pPIC9K-SUMO-GNLY9；pPIC9K-XynCDBFV-GNLY9。研究结果显示，通过SDS-PAGE检测摇瓶发酵液上清，发现单独表达的GNLY9以及与木聚糖酶XynCDBFV融合的形式均无目标条带，与SUMO融合表达的菌株能够看到清晰的表达条带，摇瓶水平的表达量达到约100mg/L，经过阳离子柱分离纯化，得到的重组GNLY9蛋白具有对沙门氏菌CVCC541和大肠杆菌CVCC3367的杀菌活性。 综上所述，本论文通过融合表达的方式，成功在毕赤酵母表达系统中实现溶菌酶、防御素和颗粒溶素3种抑菌蛋白的高效表达。研究内容为工业规模化生产抑菌蛋白奠定了基础，同时也为推进我国人用、兽用抗菌药使用减量化行动提供有效的技术支撑。
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