摘要
研究背景： 心房颤动（AtrialFibrillation，AF）是一个全球性的医学问题。35岁以上中国居民的心房颤动患病率为0.7%，≥75岁中国居民的心房颤动患病率高达2.4%，房颤患病率随着年龄增加而升高，房颤的疾病负担已经成为重大的公共卫生问题。加权基因共表达网络分析（WeightedGeneCo-expressionNetworkAnalysis，WGCNA）是一种系统的生物信息学方法，通过将复杂生物过程中的基因共表达网络划分为不同的基因模块，将基因模块与临床特征相关联，从中找到关键基因模块，从而识别潜在的关键基因。孟德尔随机化方法（MendelianRandomization，MR）是利用与暴露因素具有强相关的遗传变异作为工具变量，间接地获得暴露因素与研究结局之间的因果关联效应，从而能够避免病例对照研究设计中所存在的因果时序难辨和混杂因素干扰的缺陷。本研究基于WGCNA方法分析筛选出与房颤风险相关的关键基因，采用MR研究设计探讨候选基因（ApolipoproteinE，ApoE）与房颤风险之间的因果关联。 研究目的： 本研究采用WGCNA方法筛选出与房颤发病风险相关的关键基因ApoE，同时采用孟德尔随机化研究设计，以ApoE基因rs405509(G/T)位点变异为工具变量探讨ApoE水平与房颤发生风险之间的因果关联。 研究方法： 1.WGCNA方法：从GEO数据库中检索与“atrialfibrillationandhomosapiens”相关的基因表达谱和miRNA表达谱（GSE68475和GSE62871）。利用R软件读取原始的基因表达数据，并进行基因探针转换、数据归一化等预处理。通过R软件的LIMMA（LinearModelsforMicroarrayData）程序包对数据集GSE62871进行差异表达分析，设定阈值为差异倍数|log2FC|＞0.5且未校正的P＜0.05，筛选得到差异表达基因（DifferentiallyExpressedGenes，DEGs）。利用R软件的WGCNA程序包对DEGs和GSE68475数据集分别构建基因模块和miRNA模块，并筛选出与房颤关联最大的基因模块和miRNA模块作为靶标进行后续分析。利用TargetScan和在线数据库miRNet对筛选得到的miRNA模块中的miRNA进行靶基因预测。利用Veen图对预测得到的靶基因与基因模块中的基因进行可视化分析获得共同的基因。基于STRING数据库对获得的共同基因进行蛋白质相互作用网络（Protein-ProteinInteraction，PPI）构建以及可视化分析。使用Cytoscape软件中的cytoHubba插件筛选得到关键基因。结合GO数据库、KEGG数据库以及FunRich数据库对共同基因进行功能富集分析。 2.孟德尔随机化研究设计：共纳入AF患者1157例，对照组1206例。对研究对象的一般情况、临床指标进行收集并保留血样标本。实验室ELISA检测获得ApoE水平；从血样标本中提取DNA，采用RFLP-PCR基因分型，得到ApoE基因rs405509(G/T)位点的多态性，并将该位点作为工具变量，结合实验室检查所得ApoE水平，分析ApoE基因型-ApoE水平、ApoE基因型-房颤结局之间的关联，通过Wald比值法，探究ApoE水平和AF发生风险间的因果关联。 研究结果： 1.加权基因共表达网络分析研究共筛选出31个共同基因，结合PPI网络分析得到10个关键基因，分别为GABBR2、ApoE、CD68、C1QB、CIQC、SSTR2、SUCNR1、IL-13、SLC6A4、ADAP2。基因生物学通路主要富集在HDL-C所介导的脂质转运、免疫系统调节、乳糜微粒所介导的脂质转运、离子通道的激活等生物学通路。 2.孟德尔随机化研究共纳入2363例研究对象，其中房颤组1157例，对照组1206例。房颤组ApoE平均水平9.89（±2.81）mg/dL高于对照组9.53（±2.60）mg/dL，房颤组和对照组间的ApoE水平差异存在统计学意义（P=0.018）。ApoE基因rs405509(G/T)位点与房颤之间的关联的回归系数βZY为0.231（OR=e0.231=1.26，95%CI：1.035-1.533），即与携带TT基因型个体相比，只要有一个等位基因G突变，个体发生房颤的风险增加26%。ApoE基因rs405509(G/T)位点与ApoE水平之间的关联系数βZX为1.386（95%CI：1.024-1.749），即与携带TT基因型个体相比，每增加一个G突变等位基因（GT/GG），ApoE水平增加1.386mg/dL。通过孟德尔随机化法推断出的ApoE水平与房颤风险的关联回归系数βXY=βZY/βZX=0.231/1.386=0.167，经自然指数变换后，ApoE水平每升高1mg/dL，个体发生AF的风险增加18%（OR=e0.167=1.18）。传统流行病学方法直接获得的ApoE水平与AF发生风险之间的关联β’XY=0.057，表明ApoE水平每升高1mg/dL，个体发生AF的风险增加6%（OR=e0.057=1.06，95%CI：1.015-1.104），略低于MR推断结果，提示MR研究ApoE水平增加与房颤风险之间的因果关联更为可靠。 研究结论： 1.基于WGCNA方法筛选出10个关键基因，其中GABBR2、ApoE、CD68、C1QB基因的表达产物可能是与房颤发生相关的潜在生物标志物。 2.采用孟德尔随机化法验证了ApoE水平与房颤风险之间存在因果关联。
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