摘要
硒是一种机体必需的微量元素，以硒蛋白的形态发挥生物学作用。硒蛋白中磷脂氢型谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）是目前已知的唯一可直接还原脂质过氧化物的还原酶，参与机体的多种生理功能，但对炎症反应的影响鲜有报道。本研究采用GPX4抑制剂FIN56和RSL3建立巨噬细胞GPX4失活模型，探究GPX4失活对LPS诱导的巨噬细胞氧化应激、细胞因子和炎症信号通路的影响，以期揭示GPX4调控炎症反应的机制。 为了确定GPX4抑制剂FIN56和RSL3的使用浓度，本试验通过体外培养巨噬细胞株RAW264.7，设立对照组（DMSO）：添加与抑制剂处理组同体积DMSO；FIN56处理组（FIN56）：添加0.1~5μmol/LFIN56；RSL3处理组（RSL3）：添加0.05~1.5μmol/LRSL3，采用CCK-8法检测细胞活性，WesternBlot实验检测GPX4蛋白表达水平。结果表明，在一定剂量范围内，FIN56和RSL3对巨噬细胞活性无显著影响（P＞0.05），但随着剂量加大和处理时间延长，巨噬细胞活性逐渐降低。与对照组相比，0.5μmol/LFIN56处理24h可显著降低巨噬细胞GPX4蛋白表达水平（P＜0.05），0.1μmol/L的RSL3处理24h对巨噬细胞GPX4蛋白表达水平有下调的趋势（P＜0.1）。因此，试验最终选用0.5μmol/LFIN56和0.1μmol/LRSL3处理细胞，处理时间为24h。 为了确定LPS成功诱导巨噬细胞炎症反应，试验通过体外培养巨噬细胞株RAW264.7，设立对照组（DMSO）：添加与LPS组同体积DMSO；LPS刺激组（LPS）：添加LPS至终浓度为100ng/mL，采用ELISA和RT-qPCR检测促炎细胞因子分泌和转录水平。结果表明，100ng/mLLPS刺激巨噬细胞3h可引起IL-6分泌水平和转录水平显著升高（P＜0.05），同时显著增加IL-1β和TNF-α转录水平（P＜0.05）。因此采用100ng/mLLPS刺激巨噬细胞3h诱导炎症反应。 为了探究GPX4失活对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的影响，对巨噬细胞株RAW264.7体外培养，设立对照组（DMSO）；FIN56组（0.5μmol/LFIN56）；RSL3组（0.1μmol/LRSL3）；LPS对照组（添加同体积DMSO预处理24h后加入100ng/mLLPS继续培养3h）；LPS-FIN56组（添加0.5μmol/L的FIN56预处理24h后加入LPS继续培养3h）；LPS-RSL3组（添加0.1μmol/L的RSL3预处理24h后加入LPS继续培养3h），采用荧光染色法检测细胞ROS水平，ELISA和RT-qPCR检测细胞因子分泌与转录水平，WesternBlot实验检测炎症信号通路蛋白表达水平。结果表明，GPX4失活显著增加LPS诱导的ROS水平（P＜0.05），但对MDA含量无显著影响（P＞0.05）。FIN56显著降低LPS诱导的IL-6分泌水平和转录水平（P＜0.05），RSL3显著降低LPS诱导的IL-6分泌水平（P＜0.05）。GPX4失活显著下调了JNK、c-Jun和STAT1磷酸化水平（P＜0.05），但对Erk1/2和p38蛋白表达无显著影响（P＞0.05）。结果表明，GPX4抑制剂FIN56通过下调LPS诱导的巨噬细胞JNK、c-Jun和STAT1磷酸化，降低IL-6分泌水平和转录水平，对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应具有抑制作用。 综上所述，GPX4抑制剂FIN56显著降低了LPS诱导的巨噬细胞IL-6的分泌水平和转录水平，这是通过下调JNK和STAT1信号通路实现的。同时，我们还发现GPX4失活上调了LPS诱导的ROS蓄积。本研究结果为以GPX4为靶点开发抗炎治疗策略提供科学依据。
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