摘要
产超广谱β-内酰胺酶细菌（ESBLs-producingbacteria）在食品动物中具有很高的流行性，给公共卫生安全带来了极大的隐患。目前，耐药流行病学基本解答了ESBLs基因在全球范围内的流行状况和传播机制，但对于肠道菌群这一“微环境”中的分布特征和传播转移机制却知之甚少。本研究以规模化养殖场的肉鸡为研究对象，对其肠道内容物进行从出生到出栏的定向跟踪采集，以研究在自然饲养状态下，鸡肠道菌群内的ESBLs及其传播载体的分布、扩散及演化规律。 本研究对单一鸡肠道从出生到出栏分8次采集其粪便样品，利用添加抗生素的显色培养基（头孢泊肟（2mg/L）+万古霉素（20mg/L）+利奈唑胺（20mg/L））筛选分离、应用MALDI-TOFMS进行种属鉴定，建立耐药革兰氏阴性菌菌株库。结果表明，共分离获取482株头孢泊肟耐药菌，其中大肠杆菌397株，占比82.4%；肺炎克雷伯菌46株，占比9.5%；弗氏柠檬酸杆菌39株占比8.1%。其中大肠杆菌从试验鸡的出生到出栏持续存在，而肺炎克雷伯菌和弗氏柠檬酸杆菌只在采样前期出现。397株大肠杆菌ESBLs基因检测，结果显示，338株（85.1%）携带blaCTX-M-1型基因，63株含有blaCTX-M-9型基因（15.9%），213株可检测到blaTEM-3型基因（53.6%），部分菌株同时携带2种或者3种上述基因。选取blaCTX-M-1阳性菌株做进一步研究，利用RAPD和PFGE进行菌株亲缘关系分析。PFGE分型显示，blaCTX-M-1阳性大肠杆菌中有3种克隆型分布广泛，将这3种谱型分别命名为a、b、c克隆型。选取3个克隆型内不同采样时间点的菌株进行blaCTX-M-1的亚型分析，结果显示其均为blaCTX-M-55亚型。 为了探明blaCTX-M-55传播载体在肠道内随时间的演化和变异规律，本研究选取大肠杆菌优势PFGE克隆型（a型）内3株分离自不同时间点的代表菌株进行结合转移试验。有趣的是，利用S1-PFGE对结合子及其原始菌株进行质粒图谱分析发现，3个结合子中的质粒（pECD8-2、pECD15-5、pECD46-2）呈现大小不一的形态。利用全基因组测序技术对此现象进行解析，成功获得3个结合子中的质粒全序列。生物信息学分析显示，3个质粒骨架高度同源，不同之处在于，相较于pECD8-2，pECD15-5和pECD46-2通过大片段的缺失形成新的质粒。 本研究选取自市场上收集的4种不同品牌益生菌产品，利用构建的blaCTX-M-55大肠杆菌的鼠肠道定植模型，探索益生菌对blaCTX-M-55菌株的抑制作用。结果表明，3号益生菌产品在治疗后的第7天可降低鼠肠道内的blaCTX-M-55大肠杆菌载量，其余产品与PBS对照相比，均无显著差异。这一初步结果提示，部分益生菌可能对于抑制肠道耐药菌具有一定的作用。 综上所述，单一鸡肠道中ESBL菌株存在宿主多样性和基因亚型多样性的特点。blaCTX-M-55携带质粒的多形态共存现象也提示，宿主细菌处于不同环境时，其携带质粒可发生变化以利于宿主的适应性生存。初步探索商品化益生菌对于blaCTX-M-55菌株的研究发现，部分益生菌产品可能对于抑制肠道耐药菌具有一定的作用。上述研究对于理解耐药基因在肠道菌群中的发生发展以及耐药性的防控均具有一定的科学意义。
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