摘要
苦茶碱是天然的嘌呤生物碱，具有镇静催眠、抗抑郁等保健功效。培育富含苦茶碱的茶树新品种能提高茶叶的健康价值，满足大众对新颖、健康茶产品的消费需求，提高经济效益。但目前我国的高苦茶碱茶树种质资源稀少，苦茶碱的合成及调控机制尚未明确。课题组前期构建了以高苦茶碱茶树资源‘乳源苦茶’（RY）为父本，优良品种‘中茶302’（ZC）为母本的遗传群体，本研究对该遗传群体的生化成分进行鉴定，并利用集群分离分析结合转录组测序（BSR-Seq）初步鉴定了苦茶碱合成的关键候选基因TcS，同时发掘了不同茶树资源中TcS等位基因，开发能快速鉴定高苦茶碱单株的功能标记。本研究对高苦茶碱茶树种质创制和品种培育具有重要意义，也为未来研究苦茶碱合成调控机制提供了基础。主要研究结果如下： 1.利用高苦茶碱茶树资源‘乳源苦茶’（RY）为父本，优良品种‘中茶302’（ZC）为母本构建的遗传群体，鉴定和筛选到了一批高苦茶碱茶树新种质。利用超高效液相色谱法对F1群体的嘌呤生物碱和儿茶素含量进行测定，结果显示，F1群体的多个单株在春、秋[]两季的嘌呤生物碱及儿茶素含量存在超亲遗传现象。F1群体一半以上单株中苦茶碱含量高于15mg·g-1，其中9个单株春季的咖啡碱含量低于5mg·g-1，可作为未来高苦茶碱、低咖啡碱品种选育的重要材料。 2.通过F1群体的极端个体进行BSR-Seq，鉴定到TcS是合成苦茶碱的关键基因，并对其进行功能验证。测序结果与‘舒茶早’参考基因组进行比对分析，发现Chr1的40Mb附近有一个明显的连锁区域，在该区域内开发的SSR标记和前人开发的TCS1-InDel标记能明显区分高、低苦茶碱含量单株。进一步对测序reads进行无参转录组分析，筛选到1个与苦茶碱合成酶TcS高度相似（100%）的转录本序列。TcS实时荧光定量结果表明该基因仅在含有苦茶碱的材料中表达，表明苦茶碱的含量可能与TcS表达水平相关。从RY中克隆得到6972bp的TcS基因全长序列，由3个内含子和4个外显子组成，系统进化分析显示TcS与咖啡碱合成酶（CS）和可可碱合成酶（TS）基因全长序列明显区分，单独聚为一类。TcS亚细胞定位结果显示该蛋白主要位于细胞核和细胞质，并首次通过TcS稳定转化的烟草验证TcS在植物体内的功能。 3.从不同茶树种质资源中鉴定多个TcS等位基因，并分析其启动子活性。TcSa(TcS)-TcSi的核酸序列和氨基酸序列的相似性分别为99.43%和98.60%，均编码370个氨基酸，且蛋白分子量、等电点及氨基酸残基组成高度相似。TcS等位基因在体外都能催化1,3,7-三甲基尿酸合成苦茶碱，其中TcSe、TcSg、TcSi活性极低，仅为TcSa活性的4.35%、9.52%和22.22%，蛋白点突变验证了Ile-241能显著影响TcS活性。RY、白芽茶1号单株（BYC1）、白芽茶3号单株（BYC3）、中流苦茶（ZL）、土霸王苦茶（TBW）中TcS启动子分别为TcSP1、TcSP2、TcSP3、TcSP4、TcSP5，相似性在80%以上。GUS组织染色和双荧光素酶实验结果显示不同茶树资源的TcS启动子都含有一定的活性，TcSP3活性显著低于TcSP1和TcSP2。 4.开发一个可鉴定高苦茶碱育种材料的功能标记。比较不同茶树资源中TcS启动子序列差异，发现RY中TcSP1的-1654bp和-1383bp序列之间存在一段271bp的插入序列。根据该序列开发了一个TcS-InDel标记，该标记能准确区分F1群体中的高苦茶碱单株，可作为一个功能标记用于今后培育高苦茶碱茶树品种。
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