摘要
纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌性抗生素，可有效抑制真菌的生长繁殖和真菌毒素形成。纳他霉素具有用量少、抑菌效率高和稳定性高等特点，广泛应用于食品原材料保鲜和成品防腐以及医药等多方面。同时随着人们对食品安全管理的重视，纳他霉素的市场需求逐年增加，但目前纳他霉素偏低的生产水平和较高的生产成本，限制了纳他霉素在市场中的应用。近几年来，随着诱变选育及多种筛选手段的报道，为利用诱变育种提高纳他霉素产量以及筛选耐低pH菌株提供了可能性。本论文以褐黄孢链霉菌（StreptomycesgilvosporeusTUST01）作为出发菌株，利用诱变育种结合合适的筛选方式筛选出一株高产菌株（S.gilvosporeusY-4-23）和一株耐低pH的菌株（S.gilvosporeusY-10），并对Y-10的耐酸机制进行了研究。目的是提高纳他霉素产量，降低纳他霉素发酵生产中条件的限制，降低耗碱量以降低成本，为进一步基因组重排育种提供优良性状原始出发菌株。主要研究结果如下： （1）本论文通过对出发菌株S.gilvosporeusTUST01的发酵性能进行鉴定，初始菌株5L发酵罐补料培养条件下纳他霉素最高产量为14.76g/L，希望筛选出高产菌株的纳他霉素产量较出发菌提高20%及以上；出发菌株在不控制pH的5L发酵罐补料培养条件下，发酵过程中明显受到低pH环境对菌株生长的限制，通过比较各项参数，确定筛选耐酸菌株的目标耐受低pH值为4.4。为获得目标菌株建立了高效合理的筛选方式并确定了24深孔板最佳装液量和最佳密封方式等筛选条件。 （2）本论文以褐黄孢链霉菌S.gilvosporeusTUST01为出发菌株，采用硫酸二乙酯（DES）诱变和常压室温等离子体（AtmosphericandRoomTemperaturePlasma，ARTP）诱变技术并结合链霉素抗性筛选及24深孔板高通量筛选出高产菌株S.gilvosporeusY-4-23。利用5L发酵罐补料培养进一步地提高了菌株发酵水平，高产菌株发酵120h纳他霉素最高产量达18.07g/L，较出发菌株提高22.43%。对Y-4-23连续15代培养，每隔3代测其纳他霉素产量及生物量，结果表明Y-4-23遗传性能稳定。 （3）采用ARTP诱变结合低pH平板筛选及24深孔板筛选，最终筛选到一株在pH4.0固体培养基平板上生长旺盛的菌株S.gilvosporeusY-10。耐酸菌株Y-10在pH4.0平板上生长良好且在pH4.4和pH7.4摇瓶发酵条件下，生物量和纳他霉素产量都有显著提高，说明Y-10具有较好的耐酸能力。控制不同pH条件下于5L发酵罐中进行工艺放大。当不控制pH时，菌株Y-10生长旺盛且最大生物量达32.40g/L，较出发菌提高56.22%，但发酵效价仅为5.58g/L；而在控制pH6.3的正常5L发酵罐条件下，Y-10生物量最高达29.25g/L，且在整个发酵过程中较出发菌少消耗浓度为2mol/L的NaOH350mL，但纳他霉素产量仍只有5.80g/L左右。较高的生物量同样证明Y-10具有较好的耐酸性，而产量偏低可能是由于在5L发酵罐发酵过程中菌体异常上浮导致菌体与培养基接触较少，没有充分利用碳氮源导致。将Y-10菌株进行连续15代的培养并测定其纳他霉素产量和生物量证明筛选菌株的遗传性状稳定。 （4）在生理水平研究了低pH条件对S.gilvosporeusY-10的影响。通过比较Y-10与出发菌的胞内pH（pHi）及胞内ATP的差异研究其耐酸机制。结果表明Y-10在pH较低的环境中胞内pH（pHi）更高，保持pHi的相对稳定有利于Y-10在低pH环境中的生长代谢。此外Y-10的胞内ATP水平较出发菌明显提高，ATP能够将胞内H＋排出胞外以维持pHi稳定，进而保证其在酸性条件下的正常生长。通过对筛选到的耐低pH菌株Y-10和出发菌进行代谢组学分析，对检测到的多种小分子代谢物进行主成分分析和正交偏最小二乘分析，发现脂肪酸作为生物标志物在S.gilvosporeusTUST01和S.gilvosporeusY-10间有显著变化。Y-10的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸相对含量较出发菌明显降低，直接影响了细胞膜的流动性。Y-10纳他霉素产量低可能受到膜流动性的影响。出发菌甘露糖与D-葡萄糖相对含量较Y-10更高，与出发菌较高的纳他霉素产量相一致。
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