摘要
分子信标（MolecularBeacon,MB）是一种发卡结构的荧光探针，其应用十分广泛，可以识别蛋白质及反义寡核苷酸。但是，大多数MB/蛋白质的相互作用是非特异性的，会干扰选择性靶标结合。而核酸适配体可以基于独特的三维构象识别特定的靶标，将核酸适配体引入分子信标中，解决了MB无法特异性识别靶标物的缺点，使MB在蛋白质和多肽的检测、mRNA的监测、活细胞实时成像等方面得到了广泛应用，提高了其在化学、生物和医学等领域中生物分子的识别检测优势，在疾病诊断和治疗领域中有着潜在的应用前景。然而，单纯MB的检测灵敏度不高，通常需要信号放大方法来提高检测目标物的灵敏度。滚环扩增技术（RCA）作为一种等温酶促反应，分子量可达成百上千个碱基，且都是重复的碱基序列，将该技术引入MB的结构构建中，可以得到成百上千个重复的检测单元，从而实现信号的放大，提高检测灵敏度。本论文结合MB和适配体的特点，首先构建了三种不同锁式结构的单分子信标，然后将滚环扩增技术引入到锁式分子信标中，构建成具有多个重复检测单元的聚分子信标，由于聚分子信标是由多个重复的单MB结构构成，因此与单MB相比，聚分子信标的荧光信号明显增强，可用于检测凝血酶和癌细胞。具体内容如下： 1、不同锁式结构的适体分子信标的构建及对凝血酶的靶向检测 该部分构建了三种适配体功能化的锁式分子信标（MBs），分别为MB(8+8)、MB(15+8)和MB(15+6)，均由两条寡核苷酸链组成，一条为含有凝血酶适配体序列的长寡核苷酸链（简称SS），两端分别修饰了荧光基团FAM和猝灭基团DABCYL；另一条短的寡核苷酸链（简称cDNA）可与SS部分碱基互补。凝胶电泳与荧光光谱实验证明，MB(8+8)由一条SS和一条cDNA构成，即1对1结合；MB(15+8)由两条SS和两条cDNA构成，即2对2结合；MB(15+6)由一条SS和两条cDNA构成，即1对2结合。并且MB(8+8)和MB(15+8)可以形成猝灭的分子信标，而MB(15+6)不能形成猝灭的分子信标结构。MB(8+8)和MB(15+8)一旦遇到凝血酶，分子信标中的适配体就会和凝血酶特异性结合，形成G-四联体结构，破坏SS和cDNA的互补配对部分，MB(8+8)和MB(15+8)的分子信标结构会打开，释放荧光信号，实现对凝血酶的定量检测。在优化的实验条件下，MB(8+8)检测凝血酶的检测限为0.19nM,MB(15+8)的检测限为1.2nM。由于适配体的引入，该分子信标对凝血酶具有选择性，其他测试的蛋白质不干扰凝血酶的检测。 该部分构建了一种基于滚环扩增的锁式聚分子信标MBRCA/Thr(8+8)，其由三条寡核苷酸链组成，一条是RCA产物链，具有多个重复序列，长度可达几千个碱基；一条是含有凝血酶适配体的寡核苷酸链，两端分别修饰了FAM和DABCYL基团，且两端各有8个碱基与RCA长链中的重复单元的部分序列碱基互补配对（简称SSThr(8+8)）；还有一条固定短链简称FC-43，与RCA长链的一个重复单元中的43个碱基序列互补，起到增强RCA刚性的作用。三条链经过杂交配对即可形成荧光猝灭的聚分子信标MBRCA/Thr(8+8)。当MBRCA/Thr(8+8)遇到凝血酶，SSThr(8+8)中的适配体就会和凝血酶特异性结合，导致聚分子信标结构破坏，FAM和DABCYL重新远离，荧光信号释放，实现对凝血酶的检测。该部分探究了构建方法、RCA/SSThr(8+8)/FC-43三者之间的比例关系对MBRCA/Thr(8+8)构建的影响，对比了单分子信标MBcDNA-63/Thr(8+8)和聚分子信标MBRCA/Thr(8+8)之间构建的差异以及检测凝血酶的差异性。实验结果表明，两步退火程序有利于MBRCA/Thr(8+8)的构建；RCA和FC-43的最佳比例为1:120；RCA和SSThr(8+8)结合的最佳比例是1:3；单分子信标MBcDNA-63/Thr(8+8)的构建所需短链cDNA-63（与RCA的一个重复序列相同）和SSThr(8+8)的最佳比例为30:1；RCA与SSThr(8+8)结合的效率比cDNA-63与SSThr(8+8)的结合效率高11.75倍，RCA的效果明显优于cDNA-63；且MBRCA/Thr(8+8)检测凝血酶的检测限是0.1nM，荧光信号高，而MBcDNA-63/Thr(8+8)检测凝血酶不成线性关系，且荧光信号低，由此可以体现RCA技术的优越性。 2、聚分子信标MBRCA/Thr(8+8)的构建及对凝血酶的靶向检测 3、聚分子信标MBRCA/Thr(12+8)的构建及对凝血酶的靶向检测 上一个体系中SSThr(8+8)和RCA的结合效率较低，推测是SSThr(8+8)和RCA的碱基互补配对的个数太少，因此该部分重新设计了一条主链，记作SSThr(12+8)，即在DABCYL基团端增加了4个与RCA配对的碱基。相应的固定短链设计为两条（FC1-12，FC2-31），四条链经过杂交配对构建了聚分子信标MBRCA/Thr(12+8）。该部分探究了RCA/SSThr(12+8)/(FC1-12，FC2-31)三者之间的比例关系对MBRCA/Thr(12+8)构建的影响，对比了单分子信标MBcDNA-63/Thr(12+8)和聚分子信标MBRCA/Thr(12+8)之间构建的差异以及检测凝血酶的差异性。实验结果表明，RCA和两条固定短链的最佳比例为1:100:100，RCA和SSThr(12+8)结合的最佳比例是1:20，与上一个体系的最佳比例1:3相比，结合效率显著提高；单分子信标MBcDNA-63/Thr(12+8)的构建所需短链cDNA-63和SSThr(12+8)的最佳比例为1:1；两者之间的结合效率相差约20倍，RCA的效果明显优于cDNA-63；且MBRCA/Thr(12+8)检测凝血酶的检测限是0.13nM，而MBcDNA-63/Thr(12+8)检测凝血酶不成线性关系，且荧光信号低，由此可以体现出聚分子信标MBRCA/Thr(12+8)的优势。 4、聚分子信标MBRCA/MUC1(12+8)的构建及对癌细胞的靶向检测 在第三部分的基础上，构建能特异性靶向检测癌细胞的聚分子信标MBRCA/MUC1(12+8)，为癌症的早期诊断和治疗提供了新的思路和方法。MBRCA/MUC1(12+8)由三条寡核苷酸链组成，一条是RCA产物链；一条为含有能特异性靶向MUC1蛋白的S2.2适配体序列的寡核苷酸链（简称SSMUC1(12+8)），两端分别修饰了FAM和DABCYL，且两端分别有12个和8个碱基和RCA互补配对；另一条简称固定短链FC-41，与RCA一个重复序列的41个碱基互补配对。由于乳腺癌细胞（MCF-7）以及宫颈癌细胞（Hela）的细胞膜表面都过表达MUC1蛋白，因此当MBRCA/MUC1(12+8)遇到MCF-7和Hela细胞后，MBRCA/MUC1(12+8)中的S2.2适配体序列就会和癌细胞表面的MUC1蛋白特异性结合，破坏MBRCA/MUC1(12+8)的结构，使荧光信号增强。该部分探究了RCA/SSMUC1(12+8)/FC-41三者之间的比例关系对MBRCA/MUC1(12+8)构建的影响，探讨了MBRCA/MUC1(12+8)检测癌细胞的特异性，并对比了单分子信标MBcDNA-63/MUC1(12+8)和聚分子信标MBRCA/MUC1(12+8)检测癌细胞的能力。荧光光谱实验表明，RCA与FC-41的最佳比例为1:100，RCA和SSMUC1(12+8)最佳比例为1:20；酶标仪和流式细胞仪的结果表明，MBRCA/MUC1(12+8)能特异性识别MCF-7和Hela细胞，而对成纤维细胞（L929）的作用信号低，且与单分子信标MBcDNA-63/MUC1(12+8)相比，聚分子信标MBRCA/MUC1(12+8)识别癌细胞的荧光信号强，显示了聚分子信标MBRCA/MUC1(12+8)信号放大的优势。
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