摘要
目的： 从一系列新型DPP-4抑制剂化合物中筛选出对2型糖尿病具有安全、有效治疗潜力的化合物3e，并探讨3e对2型糖尿病小鼠的治疗作用及可能的机制研究。 方法： （1）通过体外DPP-4抑制活性测试、细胞毒性试验、药代动力学试验、体内DPP-4抑制活性测试及对正常ICR小鼠的急性口服糖耐量试验筛选出化合物3e具有成为安全、有效治疗2型糖尿病药物的潜力。然后探究化合物3e对2型糖尿病小鼠长期降血糖的作用及机制研究。 （2）24只雄性C57BL/KsJdb/db小鼠，按血糖值和体重随机分成模型组（Model）、阳性药组（Alogliptin，10mg/kg）、3e高剂量组（3e10mg/kg）、3e低剂量组（3e3mg/kg）。另将6只雄性db/m瘦小鼠作为正常对照组（Control），小鼠均喂以普通饲料。适应性喂养一周后，各组小鼠灌胃给药4周（Model组与Control组小鼠灌胃给予超纯水），每周观察小鼠的一般状态，记录小鼠体重，空腹血糖（FBG）。于给药第22天，进行口服葡萄糖耐量试验，同时ELISA法测定小鼠空腹胰岛素和糖负荷30min后胰岛素水平；于给药第29天，实验结束，取血后，处死动物，取肝脏、肾脏、胰腺组织，分离胰岛；全自动血生化仪检测各组小鼠血清标本中总胆固醇（TG）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）及糖化血红蛋白（HbA1c）的含量；ELISA法测定小鼠血清胰高血糖素样肽-1（GLP-1）水平，试剂盒测定游离脂肪酸（FFA）含量；HE染色法对各组小鼠的肝脏、肾脏、胰腺组织进行染色并观察其病理变化情况；免疫荧光染色法对小鼠胰岛中β细胞和α细胞进行染色，观察其含量和分布变化；WesternBlot法测定小鼠胰岛β细胞中GLP-1R、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、FOXO1、p-FOXO1、PDX1、cleaved-caspase3蛋白表达水平。 结果： （1）DPP-4体外抑制活性测试共发现了5个（2e，2f，2h，2i，2k）具有皮摩尔活性范围的新型DPP-4抑制剂，IC50值分别为0.18、0.10、0.72、0.22、0.44nM； （2）选择DPP-4体外抑制活性较好的2e，2f，2i，2k进行药代动力学评价，静脉给药后，结果显示与2e、2k比较，2f、2i的药时曲线下面积（AUC0-inf）、达峰浓度（Cmax）值较大，血浆清除较慢，半衰期（T1/2）较长，但是绝对口服生物利用度较差； （3）课题组对2f和2i进行前药设计，合成2f和2i的酯，通过细胞毒性试验MTT及药代动力学测得2f的甲酯3e具有低毒性，并改善了小鼠的口服生物利用度； （4）体内DPP-4抑制活性测试及正常ICR小鼠急性OGTT结果显示3e的体内DPP-4抑制活性可持续48小时，并可显著改善小鼠口服糖耐量； （5）与Model组比较，3e各给药组db/db小鼠体重显著升高（P＜0.05或P＜0.01），FBG显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；口服糖耐量结果显示，3e各给药组0、0.5、2h的血糖值较Model组显著下降（P＜0.05或P＜0.01），糖耐量曲线下面积较Model组有所降低（P＜0.05）； （6）与Model组比较，3e高剂量组可以显著降低db/db小鼠的空腹胰岛素水平（P＜0.01），升高糖负荷30min后的胰岛素含量（P＜0.01），而3e低剂量组的空腹胰岛素水平有所降低，糖负荷30min后胰岛素分泌量有所升高（P＞0.05）；但是，3e各给药组的胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）较Model组显著降低（P＜0.05或P＜0.01）； （7）3e能降低db/db小鼠血清中GLP-1、HbA1c含量（P＜0.05）； （8）3e能降低db/db小鼠血清中TC、TG、LDLC、FFA含量（P＜0.05或P＜0.01），同时升高HDLC含量（P＜0.05）； （9）3e能降低db/db小鼠血清中ALT、AST、BUN、CREA水平（P＜0.05）； （10）HE染色结果显示，3e可以有效改善db/db小鼠肝脏、肾脏、胰腺组织的病理学改变；免疫荧光染色结果显示，3e能改善db/db小鼠胰岛内α/β细胞分布紊乱的情况，并显著增加胰岛β细胞的含量（P＜0.01）； （11）WesternBlot结果显示，3e能上调db/db小鼠胰岛β细胞中GLP-1R、p-PI3K、p-AKT、p-FOXO1、PDX1的蛋白表达量（P＜0.05或P＜0.01）；并能降低cleaved-caspase3的蛋白表达量（P＜0.01）。 结论： 通过体外、体内DPP-4抑制活性测试，药代动力学测试、正常ICR小鼠急性OGTT实验筛选出的具有安全、有效2型抗糖尿病潜力的化合物3e，能改善db/db小鼠的糖脂代谢、胰岛素抵抗状态，对糖尿病引起的肝脏、肾脏、胰腺组织的损伤有保护作用，其机制可能与激活胰岛β细胞内GLP-1R-PI3K-AKT-FOXO1信号通路有关。
NETL