摘要
利用脂肪酸脱羧制备烃类生物燃料是开发可再生能源的有效途径。相比于传统化学方法，生物酶法具备高效、低能耗及环境友好等优势，更具有工业化应用前景。光脱羧酶（Fattyacidphotodecarboxylase，FAP）是一类专一性强、催化效率高、催化过程无需额外添加昂贵辅因子，仅需利用蓝光即可将脂肪酸转化为烷（烯）烃的光驱动酶，在烃类生物燃料的高效可持续生物合成领域具有显著应用潜能。目前仅有偏好催化C12-C20链长脂肪酸的光脱羧酶被报道，其底物选择性机制尚未深入探究。本论文挖掘了来源于绿藻Micractiniumconductrix的光脱羧酶McFAP，并开展了异源表达及制备、酶学性质表征、催化特性及底物选择性机制等研究。本研究可为光脱羧酶的研发及应用提供科学指导，同时为阐明光脱羧酶的结构功能关系研究提供一定基础。 具体开展研究内容及结果如下： （1）光脱羧酶McFAP及其突变体McFAP-S的制备和催化特性研究。利用全基因合成技术获得了来源于绿藻Micractiniumconductrix假定的光脱羧酶基因序列mcfap，同时构建了N端缺失突变体McFAP-S（缺失1-550位氨基酸）。在大肠杆菌中实现了McFAP-S的异源表达，经镍柱亲和层析纯化McFAP-S，产率为121.8mg·L-1，全长的McFAP未能获得纯化的重组蛋白。重组的McFAP-S对链长为6-18的饱和直链脂肪酸均有脱羧活性，偏好中链脂肪酸，最适底物为正辛酸（C8∶0）（转化率＞99%）。同等反应条件下，McFAP全细胞催化软脂酸（C16∶0）脱羧的转化率是目前已报道的CvFAP（来源于Chlorellavariabilis）的1.7倍，表明McFAP比CvFAP底物谱范围更广、脱羧效率更高、表达纯化效果更好。 （2）光脱羧酶McFAP-S酶学性质表征研究。重组的McFAP-S催化正辛酸脱羧的最适反应温度为40℃，在40℃孵育6h后残余酶活力为70.23%；最适pH值为8.0，在pH8.0孵育5d后残余酶活力为65.41%；对甲醇、DMSO等有机溶剂及Ni2+、Ca2+等金属离子具有良好的耐受性；4℃避光条件下储存10d残余酶活力76.74%；考察了不同波长光对McFAP-S酶活力的影响，结果发现红光照射3h后McFAP-S残余酶活力为97.22%；在可见光照射下McFAP-S与正辛酸共孵育3h后残余酶活力＞99%。McFAP-S在30℃、pH9.0、加酶量为60μM的条件下催化正辛酸脱羧，反应30min后产物正庚烷浓度为19.07mM，转化率为95.34%。 （3）光脱羧酶McFAP-S的底物选择性机制研究。构建了McFAP-S三维结构模型，通过与CvFAP的三维结构对比分析，推测底物通道口大小对McFAP-S底物选择性有重要影响，依据二者对于不同链长底物结合位置的区别，设计了突变体S338V、S338L、S338A、L339I、T340A、T340S、McFAP-S338A/L339I/T340S及?344-347。结果显示，S338L仅保留催化软脂酸脱羧活力（为野生型的3.7%），L339I对正庚酸（C7∶0）脱羧活力相较于野生型降低了15%，对月桂酸（C12∶0）脱羧活力增加了28%，T340S对正己酸（C6∶0）脱羧活力降低了67%，S338A/L339I/T340S对正己酸脱羧活力降低了78%。以上表明S338、L339、T340可能是参与该酶底物选择性调控的关键位点。 综上所述，本论文挖掘并研究了来源于绿藻的光脱羧酶McFAP，相较已报道的CvFAP催化特性，McFAP具有偏好中链脂肪酸、脱羧活性更高、底物谱范围更广等优势，提高光脱羧酶催化中链脂肪酸脱羧生成C5-C12烷烃的效率，同时初步阐明了McFAP的底物选择性机制。
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