摘要
背景和目的：RAS信号通路过度激活可促进HCC细胞增殖，抑制细胞凋亡，并诱导细胞恶性转化、促进细胞侵袭生长和转移，在HCC的发生发展过程中发挥重要作用。多项研究表明，RAS信号通路关键基因的异常表达与肿瘤患者的预后相关。但是RAS信号通路相关基因单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）与HBV相关肝细胞癌（HCC）患者预后的关系目前尚不清楚。因此，本研究拟通过探讨RAS信号通路关键基因潜在功能性SNPs与HBV相关HCC患者术后总生存期（overallsurvival，OS）的关系，为今后HCC患者的精准个体化治疗和预后判断提供新的思路和理论依据。 方法：本研究基于中国广西地区人群的HBV相关HCC全基因组关联研究（Genome-wideAssociationStudy，GWAS）数据库，以接受肝癌切除术治疗的866例HBV相关HCC患者为研究对象，提取了RAS信号通路中位于常染色体上62个基因的SNPs位点。采用IlluminaGSA基因分型芯片（InfiniumGlobalScreeningArray-24v1.0）进行SNP检测。首先使用随机数分组的方式按1∶1比例将866例总人群分为发现集和验证集，各433例；接着，在发现集中应用多因素Cox比例风险回归分析和贝叶斯错误发现概率（Bayesianfalse-discoveryprobability，BFDP）多重检验校正筛选出与HBV相关HCC患者术后OS显著相关的SNP位点；然后，利用验证集验证，再利用生物信息学工具和公共数据库进行功能预测筛选出潜在功能性位点。此外，为了验证潜在功能性SNPs位点关联结果的可靠性，本研究应用Bootstrap自助法进行1000次重复抽样并进行多因素Cox比例风险回归分析。最后，对筛选出的潜在功能性位点进行不同遗传模型分析、联合分析以及表达数量性状基因座（expressionquantitativetraitlocus，eQTL）分析。 结果：1.从中国广西地区人群的HBV相关HCCGWAS数据库中，我们共提取了位于62个RAS信号通路基因上的11658个SNPs。在发现集人群中，发现了616个SNPs与HBV相关HCC患者术后OS相关。经过验证集验证后结果发现位于鸟嘌呤核苷酸交换因子2（SOSRas/Rhoguaninenucleotideexchangefactor2，SOS2）、RAS蛋白特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子2（Rasproteinspecificguaninenucleotidereleasingfactor2，RASGRF2）和丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activatedproteinkinase1，MAP2K1）这3个基因上的30个SNPs仍具有显著统计学意义（P＜0.05，BFDP＜0.8）。 2.经过应用HaploRegv4.1、RegulomeDB2.0和SNPinfo等生物信息学工具进行SNPs位点的生物学功能预测以及采用多因素逐步Cox回归模型分析后，最终筛选得到3个具有潜在功能的SNPs位点（SOS2rs4632055A＞G、RASGRF2rs26418A＞G和MAP2K1rs57120695C＞T）与HBV相关HCC患者术后OS独立相关，其突变等位基因均可增加患者术后的死亡风险（rs26418：GA+AAvs.GG：HR=1.43，95%CI=1.14-1.81，P=0.002；rs4632055：AG+GGvs.AA：HR=1.40，95%CI=1.15-1.71，P＜0.001；rs57120695：TC+CCvs.TT：HR=1.50，95%CI=1.14-1.99，P=0.004）。 3.我们进一步分析SNP-SNP之间的联合作用对HCC患者死亡风险的影响。我们将rs26418GA+AA，rs4632055AG+GG，和rs57120695TC+CC基因型定义为危险基因型，对rs26418位点、rs4632055位点及rs57120695位点的联合作用进行分析，结果发现与携带0个风险基因型的HCC患者相比，携带1个，2个或3个风险基因型的患者术后的死亡风险更高（死亡率分别为0个：38.9%；1个：50.1%；2个：60.2%；3个：85.7%），且该死亡风险随着携带危险基因型个数的增加而增加，存在剂量-反应效应（风险比分别为1个：HR=1.90，95%CI=1.25-2.89；2个：HR=2.32，95%CI=1.53-2.50；3个：HR=3.62，95%CI=2.23-5.88；Ptrend＜0.001）。 4．在预后预测模型中，与单独使用临床因素（年龄、BCLC分期、AFP水平和癌栓情况等）构建的模型相比，临床因素合并联合风险基因型构建的预测模型可以提高对HBV相关HCC患者术后OS的预测能力（3年生存：72.63%vs74.32%，P=0.042；5年生存：72.16%vs74.41%，P=0.026；10年生存：66.62%vs74.94%，P=0.005）。 5.本研究利用GTEx数据库对与HBV相关HCC患者预后相关SNPs进行eQTL分析，结果发现在670例健康人群的全血细胞中rs4632055G等位基因与SOS2mRNA的表达水平降低相关（P＜0.001）。基于TCGA数据库分析结果显示在HCC癌组织中SOS2mRNA呈高表达水平，而其低表达水平增加HCC患者的死亡风险。接着，基于COSMIC数据库分析HCC癌组织中的SOS2基因体细胞突变情况，发现该基因存在一定程度的体细胞突变率（1.45%），同时发现存在SOS2基因突变的患者预后差，且SOS2mRNA表达水平与肿瘤突变负荷（tumormutationalburden，TMB）水平负相关（P＜0.05），提示SOS2基因体细胞突变也可能影响SOS2mRNA表达水平和HCC预后。 6.本研究还发现在GTEx数据库的208例正常肝脏组织中，rs26418A等位基因与RASGRF2mRNA的表达水平降低相关（P=0.008）。基于TCGA数据库分析发现，在HCC癌组织中RASGRF2mRNA均呈高表达水平，而其低表达水平可以显著缩短HCC患者OS。另外，基于COSMIC数据库本研究发现RASGRF2基因在HCC癌组织中存在一定程度的体细胞突变率（2.00%），且RASGRF2mRNA表达水平和TMB水平负相关（P＜0.05），提示RASGRF2基因体细胞突变可能影响RASGRF2mRNA表达水平和HCC预后。 7.本研究并未发现rs57120695（C＞T）等位基因和MAP2K1mRNA表达水平相关。 结论：本研究发现了3个与HBV相关HCC患者术后OS相关的SNPs（SOS2rs4632055A＞G、RASGRF2rs26418A＞G和MAP2K1rs57120695C＞T），而且这3个SNPs风险基因型的联合作用可协同增加患者术后的死亡风险。
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