摘要
本研究分为三个部分:1、广西医科大学第一附属医院肝胆外科单中心的乙肝表面抗原阳性的原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)患者的血清甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)水平的临床流行病学调查;2、按照入组人群中进行不同的血清AFP水平分类，进行全外显子基因组关联分析，并进行人群验证;3、影响AFP水平的遗传变异在细胞株中的初步验证。 第一部分 影响乙肝病毒表面抗原阳性的原发性肝细胞癌患者的血清甲胎蛋白水平的临床因素分析 目的:了解影响乙肝病毒表面抗原阳性的原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)患者的血清甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)水平分布的影响因素，以及甲胎蛋白水平对于患者预后的影响。 材料与方法:我们收集广西医科大学第一附属医院肝胆外科单中心的乙肝表面抗原阳性的原发性肝细胞癌患者223例，并按照AFP水平400ng/ml为截断值分为两组，分析临床因素对于其水平分布的影响。将AFP水平分布与随访资料结合起来分析其对于预后的评价作用。单因素分析采用卡方检验和带有Log-rank检验的K-M分析，多因素分析采用Logistic回归与Cox风险比例模型。统计软件为SPSS16.0。 结果:纳入研究的患者的术前血清AFP水平分布在2.17-60，500ng/ml.在临床因素与血清AFP水平分布(400ng/ml)的关联研究中，我们观察到年龄[OddRatio(OR)=0.42,95％confidenceinterval(CI)=0.45-0.73,P=0.002]和肿瘤大小(OR=0.43，95％CI=0.24-0.76，P=0.004)与AFP水平分布存在显著的关联。进一步的，我们观察到AFP的水平分布与入组人群的无瘤生存时间显著相关[HazardRatio(HR)=0.71，95％CI=0.52-0.95，P=0.016]。在矫正了影响入组人群的预后危险因素术后介入状态、根治性切除、抗病毒治疗、年龄以及巴塞罗那分期之后，AFP水平的分布差异与患者的无瘤生存时间仍然存在着强关联(AdjustedP=0.01)。在按照年龄和肿瘤大小进行分层分析的过程中，我们观察到，年龄大于46岁或肿瘤大于8cm的人群中，AFP水平大于400ng/ml的患者可获得更差的预后(age＞46year:HR=0.66，95％CI=0.43-0.99;tumorsize＞8cm:HR=0.54，95％CI=0.31-0.95).在探索患者一年内复发和两年内复发与血清AFP水平的关联研究中，我们也观察到了相同的结果(1-year:P=0.0007;2-year:P=0.004)。 结论:1、在本研究中，年龄(46岁)和肿瘤大小(8cm)是显著影响血清AFP水平(400ng/ml)的影响因素。 2、血清AFP水平(400ng/ml)的差异可能是预测患者术后复发的独立危险因素。 3、在年龄较大（＞46岁）和肿瘤较大(＞8cm)的乙肝表面抗原阳性的原发性肝细胞癌的人群中，其术前高血清AFP水平(＞400ng/ml)可能会获得更差的预后。 第二部分 影响乙肝表面抗原阳性的原发性肝细胞癌患者血清AFP水平的全外显子关联分析 目的:对纳入研究的目的人群按照AFP水平分布进行全外显子基因组关联研究，筛选影响目的人群中血清AFP水平分布的遗传变异。 材料与方法:通过采集入组人群的手术切除的肿瘤组织样本，提取全基因组DNA。利用高通量的全外显子基因分型平台Illuminaexomebeadchip12v1对入组样本进行全外显子的单核苷酸多态性位点(Singlenucleotideacidpolymorphism，SNP)的分型。对于人群整体的质量控制我们采取以下几个方面实现:通过主成分分析来观察纳入人群是否存在分层;采纳芯片分型的样本的分型率Callrate＞95％的样本;采纳在芯片分析鉴定中，不存在模糊性别的个体;同源关系鉴定中采纳identity-by-descent(IBD)＜0.1875的的群体（即不存在亲缘关系）。对候选位点的质量控制我们采信如下方案:剔除SNP分型成功率Callrate＜95％的位点;纳入符合哈迪温伯格平衡(HWE)P＜1×10-6的位点;为了保证检验效能采纳最小等位基因频率(Minimumallelefrequency，MAF)大于0.05的位点。二期匹配组人群通过直接测序的方法获得候选位点的分型结果。基因频率矫正协变量后与患者术前血清AFP水平的分析我们使用EPACTS3.2.6软件包计算。卡方检验和多元逻辑回归模型用来评估候选位点基因频率及基因模型对于不同血清AFP水平的贡献度。对于候选位点的多态性与病人无瘤生存时间的关联分析我们使用带有Log-rank检验的K-M分析。矫正其他风险因素后评估候选位点对于生存贡献采用COX风险比例模型。统计软件为SPSS16.0。 结果:通过芯片质检过程后，一共有21，353个候选位点可以进行关联分析的研究。其中108例患者的血清AFP水平大于400ng/ml，115名患者的血清AFP水平小于400ng/ml。整体样本的分型率为99.81％。主成分分析的结果提示我们入组的人群中并没有人群分层的存在(λ=1.0178)。所有样本均不存在性别模糊和亲缘关系。由于样本量的限制，我们选择了最小等位基因频率大于0.05的单核苷酸多态性位点进行计算。芯片的分型结果的验证采用随机抽取10％样本直接测序的方法进行，结果示外显子芯片的分型和测序结果一致，结果可靠。通过计算，并没有位点在GWAS层面达到统计学显著性(P＜2×10-6，根据21，353SNPs，α＜0.05)。但是我们将坐落在基因上的P值排在前十位的位点作为候选位点。根据匹配组人群中候选位点的分型结果，联合两期数据进行统计。最终观察到3个位点rs2125739，rs1644634和rs379707的多态性与血清AFP水平分布呈现强相关。其中候选位点rs2125739等位基因T的携带者、rs1644634等位基因A的携带者和rs379707的等位基因G的携带者，可获得显著升高的血清AFP水平(rs2125739:P=1.32×10-4,rs1644634:P=2.33×10-5,rs379707:P=3.47×10-5)。此外，我们还观察到候选位点rs164634的多态性与患者的无瘤生存时间存在着显著的关联(HR=0.56，95％CI=0.41-0.78，P=5.12×10-4)。 结论:筛查出影响AFP水平的SNP:rs2125739、rs1644634和rs379707。其遗传多态性与乙肝表面抗原阳性的原发性肝细胞癌患者的血清AFP水平(400ng/ml)的分布显著相关。候选位点rs2125739、rs1644634和rs379707的等位基因T、A、G可能是血清AFP水平的高值表达等位基因。rs1644634的遗传多态性与病人的无瘤生存时问存在显著的关联。
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