摘要
马尔尼菲篮状菌病（Talaromycosis）是由马尔尼菲篮状菌（Talaromycesmarneffei，TM）引起的一种机会性、地域性流行的真菌病。该病起病隐匿，易漏诊、误诊，病原学培养确诊耗时长，病情进展迅速且严重；未经治疗的HIV/TM患者病死率极高，即使接受抗真菌治疗，病死率仍高达20.7%。另外，研究显示HIV/TM患者肝损伤发生率极高。 目的 探究马尔尼菲篮状菌感染能否通过细胞焦亡导致肝细胞损伤，并探究其分子机制。 方法 收集HIV/AIDS及合并TM感染患者的临床病例信息并开展流行病学调查，分析HIV组和HIV/TM组各病例的基本信息及各项实验室检测指标，探究两组样本间肝功能等指标有无差异，采用Logistic回归分析合并TM感染的危险因素并绘制ROC曲线寻找截断值。分别使用AML-12（小鼠正常肝实质细胞）和HL_7702（人正常肝细胞）细胞建立TM感染的细胞模型，使用流式细胞术检测TM是否对两种细胞产生损伤，乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase，LDH）实验检测细胞中有无细胞焦亡现象，透射电镜观察TM有无进入细胞内及细胞有无发生肿胀裂解现象，实时荧光定量PCR（Quantitativereal-timePCR，qPCR）实验用来检测细胞焦亡相关因子的mRNA表达水平，免疫印迹（WesternBlot，WB）实验用来检测细胞焦亡相关因子的蛋白表达水平。通过尾静脉注射途径建立TM感染动物模型，全血和肝组织使用马铃薯葡萄糖琼脂（PotatoDextroseAgar，PDA）培养基培养判断TM有无进入肝组织，病理学切片检测TM对肝脏损伤程度，透射电镜观察TM有无进入肝实质细胞内部，qPCR实验用来检测AIM2、Caspase-1/4、IL-1β/18、TNF-α和GSDMD等与细胞焦亡相关因子的mRNA表达水平，WB实验检测细胞焦亡相关因子的蛋白表达水平。 结果 1.流行病学调查显示，HIV/TM患者与HIV患者相比，CD4细胞计数（13，四分位间距IQR：8，49）、红细胞计数（3.13，IQR：2.33，3.56）、白细胞计数（3.30，IQR：2.72，6.10）、单核细胞计数（0.27，IQR：0.15，0.39）、淋巴细胞计数（0.33，IQR：0.26，0.64）和血红蛋白（80.50±19.52）等指标的表达均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；肝功能指标显示，总蛋白（59.70，IQR：56.28，66.68）和白蛋白（25.56±3.96）的表达均降低，AST（59，IQR：38，143）、ALT（31，IQR：17，58）和AST/ALT（2.63，IQR：1.49，3.34）的表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。使用倾向性评分匹配（PropensityScoreMatching，PSM）排除混杂因素干扰后，HIV组和HIV/TM组的CD4计数、中性粒细胞计数、白细胞、红细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板的表达水平无统计学差异（P＞0.05）；而HIV/TM组中白蛋白（25.56±3.96）表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），AST（59，IQR：38，142）、AST/ALT（2.63，IQR：1.49，3.34）和D二聚体（7.18，IQR：2.17，13.36）的表达水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。二分类Logistic回归模型显示：模型AUC为0.929（95%CI：0.883，0.976），灵敏度0.850，特异度0.894，约登指数0.744，截断值0.163，可认为当模型计算的预测概率大于0.163时，可判断该病例是HIV合并TM感染患者。 2.TM感染肝细胞模型显示：AML-12细胞感染TM24h后，光镜观察细胞死亡数量增加；透射电镜可见细胞内部存在真菌孢子，细胞中产生大量空洞，细胞溶胀破裂；流式细胞术显示TM感染组在24h后细胞损伤比例升高至13%，72h为33%；LDH实验显示，AML-12+TM组的细胞上清液中LDH水平显著升高，（AML-12）+TM+焦亡抑制剂NSA组表达水平相对较低，差异有统计学意义（P＜0.001）；qPCR结果显示，TM感染AML-12细胞12-24h期间，细胞焦亡相关因子AIM2表达升高2倍，Caspase-1和Caspase-4分别上调5倍和15倍，下游因子中，IL-18升高8倍，TNF-α升高12倍，GSDMD升高2倍，差异均有统计学意义（P＜0.01）；WB结果显示TM感染AML-12后与焦亡相关蛋白的表达均上升。TM感染HL_7702细胞结果与AML-12结果相似。 3.TM感染昆明（KM）小鼠模型显示：感染第2天，肝组织研磨液和血液中均能发现TM，镜下观察可见典型的帚状枝，分生孢子从顶尖端长出；第7天解剖小鼠取肝脏后行HE染色，发现小鼠肝组织出现明显的炎症病变，大量炎性细胞浸润，细胞索排列紊乱；透射电镜结果发现肝细胞中可见TM存在，细胞中有空泡产生；qPCR结果显示，TM感染小鼠后，AIM2在第7天上调约15倍，Caspase-1和Caspase-4分别上调约9倍和8倍，IL-18在第3天时上调明显（6倍），TNF-α第7天上调约25倍，差异有统计学意义（P＜0.01）。 结论 TM感染机体后可导致肝组织发生明显炎症反应；TM可进入肝实质细胞内部，其中部分真菌可被裂解；另外，TM可激活AIM2炎性小体，进而活化Caspase-1，诱导肝细胞发生细胞焦亡。该研究可为临床寻找感染后缓解内脏损伤的药物治疗靶点提供参考，也可为研究TM在宿主内休眠潜伏感染奠定基础。
NETL