摘要
嵌合抗原受体修饰T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR T)是一种新型有效的肿瘤免疫治疗方法，通过将能识别肿瘤抗原的受体和T细胞活化序列的蛋白融合表达在T细胞表面获得肿瘤靶向性和增殖能力，发挥持久的抗肿瘤效应。近年来，CAR T细胞免疫疗法在血液肿瘤治疗中获得了突破性进展，但由于实体肿瘤微环境中存在大量的血管内皮细胞等基质细胞和免疫抑制信号，加上肿瘤的保护性物理屏障和免疫屏障能抵抗免疫细胞的攻击，CAR T在实体瘤治疗实践中仍受到限制。因此，如何增强CAR T的肿瘤靶向性，消除肿瘤微环境的免疫抑制，是提高CAR T抗肿瘤效果的重要难题。 肿瘤微环境的内皮细胞增殖相关抗原已成为实体肿瘤免疫治疗新靶点。Endoglin(CD105)是恶性肿瘤新生血管的标志，特异性高表达于增殖状态的肿瘤血管组织内皮细胞。程序性死亡受体1（PD-1）作为免疫抑制的关键分子，则一直是肿瘤免疫微环境研究的重点，消除其对T细胞的负性作用有助于增强T细胞的抗肿瘤效果。本课题组的一系列前期研究工作，已分别成功筛选出了CD105和PD-1特异性的纳米抗体，这些纳米抗体具有分子量小、渗透性强等优点，能更好地侵入实体瘤内部发挥作用。因此，本研究希望能将纳米抗体技术与CAR T细胞治疗技术相结合，设计一种以CD105纳米抗体CAR T靶向识别区、并能够分泌PD-1纳米抗体来中和T细胞PD-1免疫抑制的新型CAR T细胞免疫疗法，从而大幅提升CAR T治疗实体肿瘤的效果。 目的： 探索构建分泌PD-1纳米抗体靶向CD105的CAR T的方法，探索CD105-PD-1/Nb CAR T细胞体内外生物学活性，初步探讨CD105-PD-1/Nb CAR T细胞抗肿瘤作用及机制，寻找一个更加有效针对肿瘤微环境的CAR T细胞克服多重屏障，为CAR T细胞治疗实体瘤提供新的思路和手段。 方法： 1.通过基因工程技术合成以CD105纳米抗体作为CAR T细胞的抗原识别域并能分泌PD-1纳米抗体的CAR序列片段，命名为CD105-PD-1/Nb CAR片段。将其CAR片段和慢病毒载体GV401分别用BamHΙ酶切鉴定后进行重组连接，构建CD105-PD-1/Nb CAR慢病毒表达载体，进行菌落PCR法鉴定，然后经DNA测序鉴定。成功鉴定后，共转染293T细胞进行慢病毒包装，收集慢病毒上清液并浓缩。 2.将不同组的病毒浓缩上清液分别感染T细胞，构建CD105-PD-1/Nb CAR T细胞、CD105/Nb CAR T细胞、Irrelevant-PD-1/Nb CAR T细胞、PD-1/Nb CAR T细胞及Mock对照组CAR T细胞。经培养后，以未感染的T细胞作为空白对照组，在荧光显微镜下观察EGFP绿色荧光的表达，并通过流式细胞术检测T细胞EGFP/His-Tag的表达率，验证是否获得稳定表达CD105纳米抗体的CD105-PD-1/Nb CAR T细胞，同时检测分泌PD-1纳米抗体的情况。 3.流式细胞术检测各组CAR T细胞与靶细胞Bel7404共培养后T细胞增殖情况。用流式细胞术检测细胞膜表面活化分子（CD25、CD69）、记忆分子（CD62L）、耗竭分子（LAG-3）的表达水平变化。 4.ELISA检测各组CAR T细胞受靶细胞Bel7404刺激后，分泌细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10）的情况，ELISPOT检测各组CAR T细胞经靶细胞Bel7404刺激后分泌IFN-γ的T细胞数量。 5.分离和纯化人肝癌微血管内皮细胞（HLCMVEC），并通过流式细胞术检测靶细胞表面CD105抗原表达情况。流式细胞术检测各组CAR T细胞对靶细胞Bel7404、人肝癌微血管内皮细胞HLCMVEC的体外杀伤作用。 6.将CD105-PD-1/Nb CAR T细胞体内过继治疗荷人肝癌肿瘤小鼠。构建NOD/SCID鼠荷肝癌（Bel7404）皮下移植瘤模型，经尾静脉注射CD105-PD-1/Nb CAR T细胞治疗荷瘤小鼠。治疗后，通过测量小鼠肿瘤的体积以及小鼠的生存率指标，评估CD105-PD-1/Nb CAR T细胞在荷人肝癌皮下移植瘤小鼠体内的抗肿瘤作用。 结果： 1.PCR和测序结果表明CD105-PD-1/Nb CAR重组慢病毒载体构建成功。将病毒液感染T细胞后，在荧光显微镜下观察到EGFP绿色荧光的表达，并通过流式细胞术对CAR T细胞的EGFP/His-Tag表达率进行验证，表明CD105-PD-1/Nb CAR T细胞构建成功。 2.ELISA结果显示CD105-PD-1/Nb CAR T细胞培养上清中的PD-1纳米抗体的分泌水平相比其他对照组显著升高，表明该CAR T细胞具有分泌PD-1纳米抗体的能力。 3.流式细胞术结果显示与靶细胞Bel7404共培养后CD105-PD-1/Nb CAR T细胞明显增殖，膜表面活化分子（CD25、CD69）、记忆分子（CD62L）的表达升高，而耗竭分子（LAG-3）的表达降低，表明该CAR T细胞具有更强的活化能力。 4.ELISA结果显示CD105-PD-1/Nb CAR T细胞受靶细胞Bel7404刺激后分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的含量增多，高于其他对照组；而各组CAR T细胞IL-10的分泌均无显著差异。ELISPOT结果显示CD105-PD-1/Nb CAR T细胞经靶细胞Bel7404刺激后，分泌IFN-γ的T细胞数量显著高于其他各对照组。这些结果表明CD105-PD-1/Nb CAR T细胞能分泌更多的抗肿瘤细胞因子，其分泌的抗PD-1纳米抗体作用到PD-1并且消除PD-1/PD-L1信号通路对T细胞功能的抑制性影响。 5.成功分离HLCMVEC原代细胞，流式细胞术结果显示到该细胞表面高表达CD105。流式细胞术结果显示CD105-PD-1/Nb CAR T细胞能在体外能特异性结合、并有效杀伤CD105+靶细胞Bel7404和HLCMVEC，且杀伤效果与效靶比呈正相关。 6.CD105-PD-1/Nb CAR T细胞体内过继治疗荷人肝癌（Bel7404）小鼠，能够明显抑制小鼠皮下的肿瘤生长，延长小鼠的生存时间，成功验证CD105-PD-1/Nb CAR T细胞在荷肝癌皮下移植瘤小鼠中的抗肿瘤作用。 结论： 本课题组的研究基于课题组前期工作中筛选出了PD-1、CD105特异性的纳米抗体，结合CAR T细胞的靶向免疫治疗新策略，首次成功构建了能够有效分泌PD-1纳米抗体、并靶向肿瘤CD105抗原靶点的新型CAR T（CD105-PD-1/Nb CAR T）细胞。该细胞在体内、外均显示明显的抗肿瘤作用。这项研究有效展示了基于纳米抗体的新型CAR T细胞通过特异性靶向肿瘤血管微环境并抑制PD-1免疫检查点的优越性，及其治疗实体肿瘤的潜力，为纳米抗体在CAR T细胞的肿瘤治疗开拓新的方向。
NETL