摘要
第一部分:HIV-1诱导巨噬细胞发生铁死亡 目的HIV-1诱导巨噬细胞死亡的形式及其机制研究较少且有争议。本研究拟通过分子流行病学、生物信息学及基础研究等技术探讨HIV-1是否诱导巨噬细胞铁死亡及其可能的机制，以期为防制AIDS/HIV的传播提供科学依据和策略。 方法通过生物信息学技术分析GEO中3个高通量测序结果数据集，分析人单核细胞来源的巨噬细胞(MDMs)感染HIV-1后的铁死亡基因的改变;对南宁市第四人民医院的HIV/AIDS患者的外周血提取PBMC，并检测铁死亡基因mRNA水平的变化及体外原代巨噬细胞和THP-1巨噬细胞感染HIV-1模型进行验证。同时采用THP-1巨噬细胞感染HIV-1Bal病毒，然后采用CellTiter-Glo(@)发光法检测感染HIV-1后或铁死亡抑制剂处理后的巨噬细胞存活情况;IronAssaykit试剂盒检测巨噬细胞内总Fe含量;DCFH-DA探针法和BODIPYTM581/591C11法分别检测巨噬细胞内总活性氧(ROS)和脂质ROS的改变;透射电子显微镜(TEM)检测感染病毒后的巨噬细胞超微结构的改变。 结果(1)通过对GEO数据库中3个数据集进行铁死亡有关的88个基因mRNA的表达水平进行分析，在感染早期，部分铁死亡正向调节基因发生改变（P＜0.05），如AURKA、HMOX1、HSPA5、MDM2、SLC7A11和SOCS1。在感染晚期，我们发现只有PTGS2(COX-2)基因在感染HIV-1后发生了2倍以上的改变;(2)HIV/AIDS患者PBMCs中铁死亡基因有正向调节趋势改变;(3)体外病毒感染巨噬细胞3天后，PTGS2、SAT1、SOCS1、SLC7A11和IREB2有显著性升高(P＜0.05);其中PTGS2、SAT1、SOCS1相对表达量升高倍数最为明显;(4)在病毒感染早期（1天至3天），感染HIV-1的巨噬细胞死亡率较高，其中在感染第2和3天细胞死亡显著（P＜0.05）;(2)HIV-1感染对巨噬细胞内总Fe水平有上调趋势（P＞0.05）;(3)HIV-1可导致细胞内TotalROS水平显著性升高（P＜0.05），在第1-4天升高的倍数分别为1.39倍、1.15倍、1.51倍和1.26倍;在LipidROS方面，感染HIV-1病毒后的1-4天，LipidROS水平升高的倍数分别为1.37倍、1.06倍、1.37倍和1.18倍(P＜0.05);(4)HIV-1感染巨噬细胞后2天和3天，细胞内MDA含量由对照组0.0915nmol/mg蛋白和0.183nmol/mg蛋白分别升高至0.218nmol/mg蛋白和0.356nmol/mg蛋白(P＜0.05);(5)HIV-1感染巨噬细胞后，铁死亡诱导剂Erastin能够加剧巨噬细胞的死亡情况差异有统计学意义（P＜0.05），但经铁死亡抑制剂Ferrostatin-1干预后，感染HIV-1的巨噬细胞死亡率降低，差异有统计学意义(P＜0.05);(6)透射电子显微发现，感染HIV-1的巨噬细胞呈细胞核大小正常，无染色质凝聚，细胞大小正常，线粒体大范围缩小，线粒体嵴减少或消失，呈现典型的铁死亡特征。 结论HIV/AIDS患者体内铁死亡基因发生了趋势性改变;HIV-1病毒感染诱导的巨噬细胞死亡可被铁死亡抑制剂缓解;细胞死亡的过程伴随着铁死亡重要诱导因素—细胞内总ROS和脂质ROS的持续蓄积，以及脂质过氧化产物MDA的增加;同时巨噬细胞死亡时细胞学形态出现了铁死亡超微结构改变。在此过程中，调节铁死亡的关键基因也发生了改变;因此，HIV-1诱导的巨噬细胞死亡方式中存在铁死亡形式。 第二部分:HIV-1通过NFAT1/COX-2脂质代谢信号轴诱导巨噬细胞铁死亡的机制研究 目的围绕第一部分研究结果，我们聚焦PTGS2这一关键基因及其编码的蛋白COX-2来探索性研究HIV-1感染巨噬细胞发生铁死亡的可能机制。 方法Q-PCR检测HIV-1感染后巨噬细胞内的PTGS2、p53、NFAT1和NF-κBmRNA水平;WesternBlots法检测HIV-1感染后巨噬细胞内COX-2和p53的蛋白水平，同时相同方法检测NFAT1和NF-κB细胞核、细胞质和整个细胞内的蛋白水平的改变;构建NFAT1沉默THP-1稳定表达细胞株;Dihydroethidium（超氧化物阴离子荧光探针）和BODIPYTM581/591C11法分别检测巨噬细胞内总活性氧(ROS)和脂质ROS;ELISA法检测细胞内花生四烯酸(AA)和前列腺素(PGE2)的含量;硫代巴比妥酸染色法检测细胞内MDA的含量;透射电子显微镜(TEM)检测感染病毒后的巨噬细胞超微结构的改变; 结果(1)感染HIV-1第2和3天巨噬细胞内PTGS2mRNA水平分别被上调约8.17倍和6.48倍(P＜0.01)，其编码蛋白COX-2水平分别被上调约5.48和2.06倍(P＜0.01);但是GPX4的蛋白水平并未发生显著改变（P＞0.05）;(2)在mRNA水平上，HIV-1感染2和3天可致NFAT1分别上调3.09倍和3.47倍（P＜0.01），NF-κB分别上调2.44倍和3.47倍（P＜0.01）;在蛋白水平上，HIV-1感染2和3天可致NFAT1上调约2.14倍和2.18倍（P＜0.05），而NF-κB在细胞核中的水平变化不明显;(3)在观察期第2天，对照组和HIV-1感染组PGE2的平均含量分别为11.01ng/ml和56.68ng/ml，PGE2被HIV-1上调约4倍(P＜0.01);在观察期第3天，对照组和HIV-1感染组PGE2的平均含量分别为18.68ng/ml和55.73ng/ml，两组差异性显著（P＜0.01）;(4)慢病毒转染效率均达到90％以上，NFAT1的mRNA水平5.2倍的降低（P＜0.01），在蛋白水平上约3.4倍的降低(P＜0.05)，转染成功;(5)NFAT1沉默后感染病毒的COX-2水平两个时间点均降低Vector组的0.89倍和0.80倍(P＜0.05);(6)HIV-1分别感染Vector组和NFAT1沉默组2天，细胞内PGE2水平分别为34.29ng/ml和18.94ng/ml，PGE2水平下调明显(P＜0.01)，分别感染3天时，两组PGE2水平分别为55.64ng/ml和39.71ng/ml，差异有统计学意义(P＜0.05);(7)总ROS在NFAT1沉默后感染HIV-1后2天与同时期Vector感染病毒组相比下降至Vector组的1.01倍(P＜0.01);脂质ROS增加至1.76倍(P＜0.01);总ROS在NFAT1沉默后感染HIV-13天后与同时期Vector感染病毒组相比下降至Vector组的0.86倍(P＜0.01);脂质ROS在NFAT1沉默后感染HIV-12天后与同时期Vector感染病毒组相比下降至Vector组的0.74倍（P＜0.01）;(8)NFAT1沉默后巨噬细胞感染HIV-13天后，线粒体缩小程度得到了缓解，线粒体嵴减少的情况的也得到了很大程度的缓解。 结论PTGS2基因水平及其编码的COX-2蛋白很可能参与调节铁死亡。NFAT1沉默后所致的COX-2的下调引起了PGE2及下游的总ROS、脂质ROS的水平下降。同时，HIV-1所致的铁死亡形态学改变也被缓解。这表明HIV-1诱导的巨噬细胞铁死亡很可能主要是通过NFAT1/COX-2脂质代谢信号轴引起的。
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