摘要
全身系统治疗是晚期肝细胞癌的主要治疗方式。2010年含奥沙利铂的FOLFOX4方案一线治疗晚期肝细胞癌获得成功，使得系统化疗成为晚期肝细胞癌治疗的可选方案之一。但肝细胞癌系统化疗总体获益有限，化疗耐药是肝细胞癌系统化疗过程中难以突破的瓶颈。细胞自噬(autophagy)已经被大量研究证实参与了肝细胞癌的治疗抵抗。RNA结合基序蛋白8A(RNAbindingmotifprotein8a，RBM8A)是组成外显子连接复合体的4种核心蛋白之一，参与调控基因转录、RNA易位、蛋白翻译、无义介导的mRNA衰变等诸多细胞生命过程;同时RBM8A还参与其他细胞过程如细胞周期调控和细胞凋亡调控等。RBM8A的遗传突变或异常表达会导致生理异常，并可能导致疾病。已有研究发现RBM8A异常表达与神经系统疾病、恶性肿瘤的发生发展有关。我们前期研究发现:RBM8A在肝癌组织中高表达，在体外肝癌细胞株中RBM8A高表达则增强了肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力，同时对细胞凋亡发挥抑制作用;体外肝癌耐药细胞株中RBM8A高表达并诱导耐药蛋白表达升高。但RBM8A参与肝癌细胞耐药的机制尚不清楚。为了进一步了解RBM8A与细胞自噬的关系以及两者在肝细胞癌化疗耐药过程中的作用，本研究通过肝细胞癌组织标本、沉默/过表达RBM8A的体外肝细胞癌细胞模型，分析RBM8A与细胞自噬的关系;再通过沉默/过表达RBM8A的对奥沙利铂耐药的体外肝细胞癌细胞模型，联合自噬诱导剂和自噬抑制剂，检测自噬水平变化对肝癌细胞耐药性的影响，分析RBM8A及自噬在肝癌细胞奥沙利铂耐药中的作用。本课题将从以下三个章节内容开展研究。 第一部分肝细胞癌中RBM8A与自噬标志蛋白LC3B、肿瘤临床病理特征以及预后相关性的研究 目的:在组织水平探讨肝细胞癌患者RBM8A表达水平与自噬标志蛋白LC3B、肿瘤临床病理特征及患者生存预后的关系。 方法:回顾性收集2016年10月至12月在广西医科大学附属肿瘤医院行手术治疗且病理结果诊断为肝细胞癌的患者60例，通过免疫组化法检测癌组织中RBM8A及自噬标志蛋白LC3B的表达，分析RBM8A与LC3B的相关性及与临床病理特征的关系，对随访资料完整的患者进行生存分析。 结果:60例肝细胞癌组织中RBM8A高表达27例(45％)，LC3B高表达25例(41.7％);RBM8A的表达水平与门脉癌栓情况(P＜0.001)，肿瘤直径(P=0.004)，Edmondson分级(P=0.017)，肿瘤TNM分期(P＜0.001)，BCLC分期(P=0.002)，LC3B的表达(P=0.048)之间具有显著相关性。RBM8A表达水平与LC3B表达水平呈正相关(P=0.007，相关系数r=0.341)。单因素分析显示是否合并门脉癌栓(P=0.001)、肿瘤直径(P=0.012)、血清甲胎蛋白(AFP)水平(P=0.004)、病理Edmondson分级(P=0.043)、肿瘤TNM分期(P=0.001)、BCLC分期(P=0.001)、是否复发(P=0.013)、RBM8A表达水平(P=0.021)、LC3B表达水平（P=0.023）均为影响预后的因素。多因素生存分析，结果显示是否合并门脉癌栓(P=0.032)、肿瘤TNM分期(P=0.035)、BCLC分期（P=0.002）、RBM8A表达水平(P=0.049)为影响肝细胞癌患者预后的独立因素。 结论:肝细胞癌组织中RBM8A与自噬标志蛋白LC3B的表达水平呈正相关。RBM8A表达水平是影响肝细胞癌患者预后的因素。 第二部分RBM8A对肝细胞癌自噬影响的初步研究 目的:在初步探讨RBM8A的表达水平与自噬标志蛋白LC3B表达相关性的基础上，通过建立RBM8A沉默及过表达的体外肝细胞癌细胞模型，检测RBM8A沉默或过表达后肝细胞癌细胞自噬水平的变化，进一步探讨RBM8A基因对于肝细胞癌自噬的影响。 方法:1、对体外肝细胞癌细胞株进行mRNA及蛋白检测，选择RBM8A表达水平最高和水平最低的细胞株，分别筛选RBM8A干扰序列和基因编码序列(CodingSequence，CDS)，分别构建敲低慢病毒载体、过表达慢病毒载体以及对照病毒载体，感染靶细胞;经qRT-PCR、Westernblot验证RBM8A表达敲低效率和过表达效率，建立稳定RBM8A沉默的RBM8A-KD细胞株及空载对照的RBM8A-NC细胞株;以及RBM8A高表达的RBM8A-OE细胞株和空载RBM8A-NC细胞株; 2、qRT-PCR、Westernblot法检测正常培养和EBSS饥饿刺激2小时后RBM8A过表达和干扰肝癌细胞中LC3A/B、RBM8A、p62的表达水平; 3、免疫荧光检测正常培养和EBSS饥饿刺激2小时后RBM8A过表达和干扰肝癌细胞中LC3的分布和表达; 4、免疫荧光检测饥饿刺激2小时后RBM8A细胞内亚定位变化。 结果:1、筛选结果显示Bel-7404细胞株的RBM8A表达水平最高，MHCC97H细胞株RBM8A表达水平最低;通过慢病毒载体成功构建了RBM8A沉默的Bel7404-RBM8A-KD肝细胞癌细胞株以及RBM8A过表达的MHCC97H-RBM8A-OE肝细胞癌细胞株用于后续细胞功能实验。 2、qRT-PCR法检测结果显示:在正常培养和EBSS饥饿刺激2小时后，MHCC97H-RBM8A-OE肝癌细胞株自噬相关标志物LC3A、LC3B的mRNA表达较空载对照组均显著升高(P＜0.05)，但p62表达水平无明显变化;在正常培养和EBSS饥饿刺激2小时后，Bel7404-RBM8A-KD肝癌细胞株自噬相关标志物LC3A、LC3B的mRNA表达较空载对照组均显著降低(P＜0.05)，但p62表达水平无明显变化; 3、Westernblot法检测实验结果显示:正常培养情况下，自噬标志物LC3A、LC3B蛋白表达在MHCC97H-RBM8A-OE中高于RBM8A干扰细胞株Bel7404-RBM8A-KD，p62蛋白表达未见明显变化。 经EBSS饥饿刺激2小时后，自噬标志物LC3A、LC3B蛋白表达在MHCC97H-RBM8A-OE中显著高于RBM8A干扰细胞株Bel7404-RBM8A-KD，p62蛋白表达在MHCC97H-RBM8A-OE中低于RBM8A干扰细胞株Bel7404-RBM8A-KD。 4、免疫荧光实验结果显示，在正常培养情况下，RBM8A干扰细胞株Bel7404-RBM8A-KD、RBM8A过表达细胞株MHCC97H-RBM8A-OE及空载的Bel7404-NC、MHCC97H-NC细胞株LC3荧光标记均较弱，未观察到明显的自噬现象。 经EBSS饥饿刺激2小时后，RBM8A过表达细胞株MHCC97H-RBM8A-OE与空载组MHCC97H-NC相比，细胞中LC3标记的斑点数量增加(P=0.0152)，而RBM8A干扰细胞株Bel7404-RBM8A-KD与空载组Bel7404-NC相比，细胞中LC3标记的斑点数量减少(P=0.0059)。RBM8A过表达细胞株MHCC97H-RBM8A-OE与RBM8A干扰细胞株Bel7404-RBM8A-KD相比，LC3标记的斑点数量显著增加(P=0.0473)。 5、自噬流监测结果显示:EBSS饥饿刺激2小时后，对比空载细胞株MHCC97H-NC，MHCC97H-RBM8A-OE中，双荧光mRFP-eGFP-LC3法可见细胞胞浆中红色、绿色亮点增多，在合成图像中由红、绿色叠加形成的黄色亮点（自噬体）和红色亮点（自噬溶酶体）同时增多，证实RBM8A诱导了自噬的活化;而在RBM8A干扰细胞株Bel-7404-RBM8A-KD中，可以观察到饥饿刺激后红色荧光亮点数量无明显变化，黄色荧光亮点增多，表明自噬体降解障碍，，证实干扰RBM8A表达使得自噬受到抑制。 6、免疫荧光染色显示:经过EBSS饥饿刺:2小时后，在低表达RBM8A的MHCC97H细胞株和高表达RBM8A的Bel-7404细胞株中RBM8A的细胞内亚定位均无明显改变。 结论:上调RBM8A基因可诱导肝细胞癌细胞自噬的活化。 第三部分RBM8A通过自噬影响肝细胞癌对奥沙利铂耐药的研究 目的:通过构建RBM8A干扰及过表达的肝细胞癌奥沙利铂(OXA)耐药模型，检测RBM8A改变后对细胞自噬水平、细胞增殖能力及耐药性的影响，并研究改变自噬水平能否逆转耐药，初步探讨RBM8A、细胞自噬与肝癌OXA耐药发生发展的相关性。 方法:1、采用OXA浓度递增法，间歇作用诱导建立耐药肝细胞癌模型BEL7404/OXA和MHCC97H/OXA，运用转染过表达技术和RNA干扰技术分别建立稳定的亲本肝细胞癌模型MHCC97H-RBM8A-OE、BEL7404-RBM8A-KD以及OXA耐药肝细胞癌模型MHCC97H/OXA-RBM8A-OE、BEL7404/OXA-RBM8A-KD; 2、qRT-PCR和WesternBlot检测LC3B在亲本/耐药肝细胞癌株的表达; 3、CCK8法检测亲本/耐药肝细胞癌细胞株的增殖能力和IC50; 4、结合自噬激动剂或自噬抑制剂，通过OXA处理后检测IC50来评估各组细胞的奥沙利铂耐药性。 结果:1、qRT-PCR、Westernblot法检测结果显示RBM8A在耐药肝细胞癌细胞株MHCC-7H/OXA、BEL7404/OXA中较亲本肝细胞癌细胞株MHCC97H-NC、BEL7404-NC中表达显著升高; 2、LC3B在奥沙利铂耐药细胞株中表达水平较亲本肝癌细胞株显著升高; 3、BEL7404/OXA-RBM8A-KD组细胞IC50值减少，肝细胞癌对OXA的耐受性显著降低，MHCC97H/OXA-RBM8A-OE组细胞IC50值升高，肝细胞癌对OXA的耐受性显著提高; 4、加入自噬激动剂雷帕霉素共培养后，上述肝癌细胞株IC50值均降低，肝癌细胞耐药性得到部分逆转，BEL7404/OXA-RBM8A-KD组IC50值最低。 5、加入自噬抑制剂氯喹共培养后，上述肝癌细胞株的IC50值升高，肝细胞癌细胞对OXA耐受性升高，其中BEL-7404/OXA-NC空载组联合自噬抑制剂氯喹IC50值最高。 结论:RBM8A在肝癌OXA耐药诱导过程中表达升高，过表达RBM8A促进体外亲本和耐药肝细胞癌的增殖，诱导自噬蛋白LC3B表达升高，提高肝细胞癌对OXA耐受性，RBM8A通过诱导自噬参与肝细胞癌对OXA的耐药过程。
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