摘要
目的：脊髓损伤（SpinalCordInjury，SCI）是一种致残率极高的中枢神经系统性疾病，一旦患病通常会造成感觉、运动功能障碍，给患者及家庭带来巨大的经济和心理负担，已经成为医学界急需攻克的重大疾病问题。因此，继续探究对SCI有效治疗的方法或药物具有重大的研究意义。经过长期筛选，我们发现广西道地药材广山楂的主要药理成分山楂叶总黄酮（TotalFlavonoidsofHawthornLeaves，TFHL）具有潜在治疗SCI的作用。在我们前期研究中发现，TFHL能明显抑制炎性因子的释放，对SCI具有一定保护作用。本研究将在原有研究基础上，进一步探究TFHL治疗SCI的潜力，为中医药的价值开发及SCI的治疗提供有力的理论依据。 方法：1.通过Q-Orbitrap高分辨液质联用技术对TFHL进行质谱数据采集。根据色谱保留时间、一级及二级质谱等信息，经过代谢组学数据分析软件CD2.1处理后，与数据库（mzCloud，mzVault，ChemSpider）进行检索比对得到相应的物质成分。 2.将清洁级成年Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为Sham组、SCI组及TFHL组。通过Allen’s打击法构建SCI模型，在TFHL治疗后，BBB（Basso,Beattie,Bresnahan）评分评估各组大鼠的运动功能情况；HE染色观察各组脊髓组织变化情况；透射电镜观察各组脊髓组织超微结构变化情况；TUNEL染色观察各组脊髓组织中神经细胞凋亡情况；Nissl染色观察各组脊髓组织中神经元尼氏体变化情况；免疫组化观察各组脊髓组织中细胞自噬情况；WesternBlot检测各组脊髓组织中自噬相关蛋白LC3，P62，Beclin-1及微管去稳定相关蛋白SCG10的表达情况。 3.体外提取并培养脊髓前角运动神经元，随机分为Control组、Hurt组、Astrocyte组、Directdrug组及Co-culture组。通过谷氨酸损伤脊髓前角运动神经元后，构建星形胶质细胞与损伤神经元的共培养模型。在TFHL干预后，光学显微镜观察各组神经元的形态变化情况；透射电镜观察各组神经元的超微结构变化情况；MAP2免疫荧光观察各组神经元轴突的再生情况；LC3-Ⅱ免疫荧光观察各组神经元的自噬情况；ELISA检测各组培养液中脑源性神经营养因子（Brain-DerivedNeurotrophicFactor，DBNF）、胶质源性神经营养因子（Glial-DerivedNeurotrophicFactor，GDNF）、神经生长因子（NerveGrowthFactor，NGF）及睫状神经营养因子（CiliaryNeurotrophicFactor，CNTF）的分泌情况；WesternBlot检测各组神经元中自噬相关蛋白LC3，P62，Beclin-1及微管去稳定相关蛋白SCG10的表达情况。 结果：1.通过Q-Orbitrap高分辨液质联用技术对TFHL进行检测得到，TFHL在mzCloud中共匹配到856个化合物，在mzCloudbestmatch中有304个化合物综合评分大于70分，其中mzCloud评分80以上的有19个化合物。再对质谱鉴定到的分析物进行质谱结构解析发现，mzCloud评分80以上的19个化合物分别为槲皮素3β-D-葡萄糖苷、芦丁、儿茶素、槲皮素、异鼠李素、金雀异黄素、黄芪素、木犀草素、（-）-表儿茶素、3-甲氧基-5,7,3'',4''-四羟基-黄酮等。 2.体内实验：BBB评分结果显示，相比较于Sham组，SCI组BBB评分明显下降，TFHL治疗后，TFHL组BBB评分有所升高（p＜0.05）。HE染色及透射电镜结果显示，SCI组脊髓组织中神经元形态混乱，细胞核有所回缩，无法区分出神经元的形态，并伴有一定炎性细胞的浸润，神经元中有一定数量的自噬小体存在；TFHL组脊髓组织及神经元形态明显好转，并出现较多数量的自噬小体。TUNEL染色结果显示，SCI组脊髓组织中出现大量细胞凋亡，相较于SCI组，TFHL组细胞凋亡明显减少（p＜0.001）。Nissl染色结果显示，SCI组神经元内尼氏体萎缩且数量减少；THFL组神经元内出现虎斑状的尼氏体且数量有所增多（p＜0.05）。免疫组化结果显示，SCI组LC3阳性细胞的平均光密度值增大，相较于SCI组，TFHL组LC3阳性细胞的平均光密度值升高显著（p＜0.01）。WesternBlot结果显示，相较于Sham组，SCI组脊髓组织中的LC3-Ⅱ、Beclin-1及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平有所升高，而SCG10、P62蛋白表达水平下降（p＜0.05）。对比SCI组，THFL组P62及SCG10蛋白表达水平下降，LC3-Ⅱ、Beclin-1及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平升高（p＜0.05）。 3.体外实验：光学显微镜结果显示，Hurt组神经元胞体明显回缩，轴突、树突断裂，相较于Hurt组，Co-culture组神经元的状态恢复最佳。透射电镜结果显示，Hurt组神经元细胞核回缩，细胞核边缘凹凸不规则，且胞质中存在处于工作状态的自噬小体，TFHL干预后，Co-culture组神经元形态恢复最佳且胞质中自噬小体的数量最多。MAP2免疫荧光结果发现，Hurt组只见显绿色荧光的神经元胞体，难以见到其轴突及树突，Astrocyte组及Directdrug组可见少许轴突再生，Co-culture组神经元轴突生长明显，且长度最长（p＜0.05）。LC3-Ⅱ免疫荧光结果发现，在Hurt组、Astrocyte组、Directdrug组及Co-culture组能观察到显红色荧光的阳性LC3-Ⅱ，比较各组LC3-Ⅱ的平均光密度值发现，Co-culture组中LC3-Ⅱ的平均光密度值最高（p＜0.05）。ELISA检测结果显示，Co-culture组中能完全检测到DBNF、GDNF、NGF、CNTF等神经营养因子的存在，且含量最多（p＜0.05）。WesternBlot结果显示，Hurt组神经元中的LC3-Ⅱ、Beclin-1及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平有所升高，P62蛋白表达水平下降（p＜0.01），SCG10蛋白表达无统计学意义（p＞0.05）。相较于Hurt组，Astrocyte组、Directdrug组脊髓运动神经元的LC3-Ⅰ、P62及SCG10蛋白表达水平下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平升高（p＜0.05），但Astrocyte组的LC3-Ⅱ蛋白表达与Hurt组间无统计学意义，且Astrocyte组和Directdrug组蛋白表达水平比较无显著性差异（p＞0.05）。Co-culture组蛋白表达水平明显，且与Hurt组、Astrocyte组、Directdrug组间均有显著性差异（p＜0.05）。 结论：山楂叶总黄酮中含有丰富的黄酮化合物，其能够有效改善脊髓微环境，降低神经细胞凋亡，提高细胞自噬及神经元的功能状态，促进脊髓运动神经元轴突再生从而发挥神经保护作用，有效缓解了脊髓的神经、运动功能障碍。
NETL